Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну

Рис.1. Загальна схема синтезу гризеофульвіну

Схема перетворення проміжних продуктів, полягає в тому що синтез гризеофульвіну йде від повністю ароматичної структури до частково насиченої. Саме таким шляхом, як правило, здійснюється синтез вторинних метаболітів з ацетату [8].

Важливе значення в процесі  біосинтезу молекули гризеофульвіну має  стадія хлорування (рис.2). Тому що в хімічній будові гризуофульвіна знаходиться атом хлору. Реакції хлорування призводить до утворення грізеофенона С, який в процесі хлорування перетворюється в грізеофенон В; останній в результаті метилювання переходить в грізеофенон А, а потім в гризеофульвін [7].

 

Рис.2. Схема синтезу гризеофульвіну

2.1. Хімічний синтез

Було проведено ряд досліджень щодо можливості хімічно синтезувати гризеофульвіну. Найбільш інтенсивно займались цим британські вчені. Саме завдяки їм у 1952 році було штучно отримано антибіотик гризеофульвін.

В 1959 році Швейцарський вчений А. Броссі повідомив про повну індентифікацію та конфігіруцію молекул з яких утворюється гризеофульвін. Незабаром після того також повідомив англіїський вчений С. Дей, про синтез гризеофульвіну та його антипода.

Починається хімічний синтез гризеофульвіну з флороглюцину, спочатку його перетворюють на його діметиловий ефір з метанольного розчину хлористого водню подальшим хлоруванням з сульфурілхлоридом [24].

Рис. 3 Початкова схема хімічного синтезу гризеофульвіну

І – флороглюцин; ІІ – диметилфлороглюцин; ІІІ – диметилфлороглюцин-4-хлорид; ІV – диметилфлороглюцин-6-хлорид;

Після цього  відбувається ряд перетворень сполуки диметилфлороглюцин-4-хлорид (ІІІ) та її конденсування з сполукою диметилфлороглюцин-6-хлорид (ІV) [24].

Рис.4 Продовження хімічної схеми гризеофульвіну

ІІІ – диметилфлороглюцин-4-хлорид; Х – похідний бензофеноліну; ХІ – бензофенолін; ХІІ – гризеофульвін.

Було досліджено та встановлено оптимальні параметри та умови для хімічного синтезу гризеофульвіну. Докладна схема викладена в додатку 2.

Хімічно синтезивувати  антибіотик гризеофульвін дуже складно. Цей процес займає багато часу та завдає багато клопоту. До того ж необхідно облаштувати лабораторію необідними приладами, щоб забезпечувати всі оптимальні умови для хімічної модифікації сполук.

Реактиви, які  потрібні для хімічного синтезу дуже високовартісні, тому можемо зробити висновок, що хімічна модифікація створення гризеофульвіну є недоцільною та неперспективною в подальшому [24].

2.2. Вплив  основих параметрів та фізико - хімічний вплив одержання гризеофульвіну

В основному, щоб  забезпечити високий вихід антибіотику у промисловості, потрібно забезпечити глибині умови культивуння. Було вивчено мінливість стану Penicillium griseofulvum за рівнем синтезу антибіотика гризеофульвіну при вирощуванні на повноцінних живильних середовищах. Найбільшу продуктивність гриба було встановлено на середовищі з джерелом вуглецю є лактоза, вона утилізується грибом повільніше, ніж, наприклад глюкоза, в результаті чого в період максимального виходу гризеофульвіну лактоза ще міститься в середовищі. [1, 19].

Стимуляція  утворення антибіотика клітинами спостерігається при добавлені до середовища виннокислого амонію [13]. В основному поширення грибів відбувається через утворення екзогенних коній (кодієспори). Формування кодієносців і споруляція залежить від екологічний факторів, наявності в субстратів солей, вуглеводів. Час, необхідний для формування кодієносців, тобто індукції клітин інтервал становить 7 – 14 год, а його довжина збільшується з віком гриба. Пряме світло пригнічує ріст гриба, але чергування освітлення і темноти стимулює і спороутворення [21]. Розвиток культури відіграє важливу роль як у лабораторних і промислових масштабах виробництва будь-якого метаболіту. За оптимальних мікробіологічних показників, а саме, вік організму, стан конідій і склад поживного середовища, можна зменшити лаг-фазу і, можливо, розширити виробництво гризеофульвіну.

Велике значення для P. griseofulvum має аерація. Максимальне його накопичення відбувається при інтенсивності аерації, близькою до одиниці. Зменшення інтенсивності аерації або її надмірне збільшення знижує вихід антибіотика. В залежності від pH культура може змінювати культуральні, морфологічні ознаки, що впливає на фізіологічну активність гриба. Тобто, кількість клітин краще розвивається при pH = 4,5 – 5,5. А синтез антибіотику краще проходить при pH = 6,5 – 7,2. Таким чином, високий вихід гризеофульвіну отримують при наступних умовах розвитку гриба: хороший ріст міцелію, достатнє забезпечення культури поживними речовинами і киснем, оптимальна температура (в період першої фази 28 °С, в період другої фази 24 °С), рівень рН = 6,5 – 7,2 повільне споживання вуглеводів, відповідний попередник [19, 21].

 

ТЕХНОЛОГІЧНА ЧАСТИНА РОБОТИ

РОЗДІЛ 3. Характеристика кінцевого продукту.

Гризеофульвін (грицин) – протигрибковий антибіотик, який виділений із Penicillium griseofulvum. Встановлено будову гризеофульвіну, молекула якого за хімічною природою є гетероциклічним антибіотиком з заміщенним в 7 положені атомом хлору.(рис.5):

Рис.5 Структурна формула гризеофульвіну.

Також існують назви дульцин, фульцин, фульвицин, гризовин, грицин, грифульвін та 7-хлор-2',4,6-триметокси-6'-метил-2'гризен-3,4'-дион [15].

Відомо точну масу однієї молекули, яка дорівнює 352,7663 М. [25]. Температура плавлення гризеофульвіну (С₁₇Н₁₇О₆Сl) складає T_плав =218 – 219 ^оС, субстанція має білий або білий з жовтуватим відтінком колір. Знаходиться у вигляді кристалічного порошку зі слабким специфічним (грибним) запахом. Практично не розчиняється у воді. Малорозчинний в етанолі, метанолі, ацетоні, бензолі, етилацетаті, оцтовій кислоті. Розчинність у диметилформаміді при 25 °C становить 12 - 14 г/100 мл. Стабільний при високій температурі до 160 °C. В ультрафіолетовому опромінені гризеофульвін має максимум поглинання при 236, 252, 291, і 324 нм. [15]

Активність  гризеофульвіну при зовнішньому  застосуванні залежить від дисперсності його кристалів і зумовленою нею  питомої поверхні порошку. Препарат пригнічує синтез білка (зв’язуючись з матричною РНК), порушує формування клітинної стінки (хітин в міцилярних грибах) і мітотичний поділ грибкових клітин [28].

Мінімальна концентрації антибіотика, яка пригнічує ріст міцелярного  гриба, мкг / мл

Microsponim cants	0,22-0,24
Microsporum attdouinii	0,40-0,46
Microsporum attdouinii	0,38-0,42
Trichophyton rubrum	0,14-0,18 [19].

Гризеофульвін - практично не токсичний препарат. Проявляє фунгістатичну дію на збудників трихофітії, мікроспорії, епідермофітії. Застосовується гризеофульвін для ентерального прийому у вигляді таблеток (по 0,125 г), суспензій (0.015 г в 1 мл), місцево – у вигляді 2,5 % лініменту. Призначається по 0,125 г 4 рази на добу в перші 3 тижні щоденно, потім через 1 або 2 дні до зникнення клінічних проявів.

Гризеофульвін посилює дію алкоголю. Під час лікування лініментом гризеофульвін потрібно утримуватись від вживання алкоголю.

При застосуванні препарату рекомендується прийом вітамінних засобів –аскорбінової кислоти  і препаратів, що містять вітаміни групи В. Зберігають при кімнатній температурі 22 ⁰С [2, 28].

 

РОЗДІЛ 4. Обгрунтування вибору технологічної схеми

4.1. Обґрунтування способу проведення біосинтезу

Процес виробництва  біологічно активних речовин в тому числі і біомаси технологічно і технічно може реалізовуватися різними способами. Особливості обраних способів біосинтезу впливатимуть на хід всього виробничого процесу. Тому технологічна схема, що покладена в основу виробництва повинна забезпечувати найкраще поєднання виробничих заходів з точним дотриманням оптимальних умов проведення кожної виробничої стадії.

Культивування продуцентів  біологічно активних речовин можна здійснювати такими способами: поверхневим, глибинним, періодичним та безперервним.

До промислових  способів культивування мікроорганізмів належать періодичне, безперервне культивування та культивування іммобілізованих клітин.

Найбільш поширений  спосіб періодичного культивування. При  даному способі інокулят вносять  у поживне середовище, яке містить  задану кількість всіх необхідних поживних речовин. При цьому ні один з істотних компонентів поживного середовища не надходить у систему у процесі культивування, тобто це закрита система [6].

Періодичне  культивування застосовується як для  поверхневих культур (на поверхні твердого поживного середовища), так і глибинних культур (в рідкому поживному середовищі). Ріст мікроорганізмів припиняється тоді, коли вміст якого-небудь з необхідних компонентів середовища досягає мінімуму або у середовищі накопичуються продукти метаболізму, що інгібують ріст мікроорганізмів.

Існує також  напівбезперервне культивування, коли частина об’єму з біореактора  час від часу вилучається при  додаванні еквівалентного об’єму середовища. Це призводить до регулярного омолодження  культури і до затримки її переходу до фази відмирання. Такий режим культивування в значній мірі уподібнюється безперервному процесу, тому називається також напівбезперервним культивуванням [6].

У безперервних процесах біооб'єкти постійно підтримуються  в експоненційній фазі росту. Забезпечується безперервний приплив свіжого поживного середовища в біореактор і відтік з нього культуральної рідини, що містить клітини та продукти їх життєдіяльності. Фундаментальним принципом безперервних процесів є рівновага між збільшенням біомаси за рахунок поділу клітин і їх зменшенням у результаті розведення свіжим середовищем.

Глибинне культивування  мікроорганізмів має ряд очевидних  переваг перед поверхневим, оскільки дозволяє значно скоротити виробничі  площі, виключити важку непродуктивну  ручну працю, покращити гігієну праці, спрощує механізацію та автоматизацію виробництва, робить можливим перехід на безперервний спосіб культивування. При глибинному способі культивування раціональніше використовуються поживні речовини середовищ, що дають можливість значно скоротити відходи виробництва у вигляді нерозчинних осадів твердого поживного середовища, отримувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою активністю. Глибинне культивування проводять у вертикальних герметичних ємностях різного розміру, що називаються ферментаторами [6].

При поверхневому культивуванні механізація процесу  вирощування можлива шляхом створення  безперервно діючих установок. В  цьому випадку мікроорганізми вирощують  на поверхні щільного середовища або  в тонкому шарі рідкого середовища, і кисень надходить до них безпосередньо з повітря.

При поверхневому культивуванні важливо збільшити  площу зіткнення середовища з  повітрям. Для цього середовища наливають  тонким шаром у посуд з широким дном – чашки Петрі, колби Виноградського, матраци. У рідких середовищах аеробні мікроорганізми часто ростуть, утворюючи на поверхні плівку. Факультативні анаероби розвиваються не тільки на поверхні, але і в товщі рідкого середовища, викликаючи більш-менш рівномірне її помутніння. Поверхневе культивування мікроорганізмів застосовується як в лабораторних умовах, так і в промисловості.

Недолік поверхневого способу – необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими  важко механізувати [6].

Отже, враховуючи всі ці дані, культивування P. griseofulvum проводимо глибинним методом. Тому, що цей мікрорганізм росте на рідкому поживному середовищі, потребує постійної аерації, частого технологічного контролю, також за глибинного методу культивування економляться виробничі площі.

4.2. Обґрунтування вибору біологічного агента для антибіотику гризеофульфіну.

У 50-х роках ХХ століття для отримання гризеофульвіну використовувався Р. nigricans, який в процесі розвитку утворює малу концентрацію патуліну (до 26,4 мг/кг ^-1). Патулін - токсична цвіль (мікотоксин). На відміну від більшості інших мікотоксинів патулін розкладається під тривалим кип'ятінням, бродіння фруктових соків або бактерій. Небезпеки для здоров'я патулін в порівнянні з іншими мікотоксинами немає. Але все ж таки, якщо патулін в організмі буде знаходитись в високій концентрації, то він може вкликати нудоту і призвести до гастриту. вихід антибіотику складав понад 300 - 350 мг/л [7, 18].

Потім гризеофульвін отримували культивуванням Penicillium urticae, який синтезував 420 г/мл гризеофульвіну. В глибинних умовах після 150 годин культивування в середовищі (г/л): кукурудзяний екстракт – 1,8; глюкози – 0,9; гідроло - 0,5; лактоза - 0,3; NH₄NO₃ – 0,9; Na₂SO₃ 5H₂O - 0,1; Na₂SO₄ 10H₂O - 0,05; MgSO₄ 7H₂O - 0,025; MnSO₄ 5H₂O - 0,002; ZnSO₄ - 0,02; KH₂PO₄ - 0,2; CaCO₃ - 0,3 та для кращого виходу продукту забезпечували поживне середовище 6 г/л NaCl.

Дане поживне середовище не є доцільним, тому що P .urticae потребує багато кукурудзяного екстракту, високої концентрація амонійних сполук та високої концентрації NaCl. Так як в середовищі міститься, в досить великих концентраціях, легко засвоюваний цукор, глюкоза, то її потрібно вносити дробно. Що до часу синтезу антибіотику, P. urticae потрибує 150 годин, для промислового використання це є не вигідно [4, 8, 19].