Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну

У біомасі міститься близько 0,2 % мангану (за елементом Мn). Отже для синтезу 8 г/л біомаси вміст мангану в середовищі повинен становити 8 × 0,002 = 0,016 г/л. Джерелом мангану у виробництві гризеофульвыну є манган сульфан.

Отже, у 400 г манган сульфату міститься 112 г мангану, тоді 0,016 г мангану міститься в (400 × 0,016) / 112 = 0,05 г.

Вибір саме такого складу середовища зумовлений розрахунками за допомогою математичних методів  оптимальних кількостей кожного  з компонентів.

Отже, з метою  одержання максимальної кількості продукту мікробного синтезу було розраховане середовище наступного складу (г/л): цукри - 28,5 ; KH₂PO₄ – 1,08; NaNO₃ – 2,28; MgSO₄ 7H₂O – 0,21; MnSO₄ H2O – 0,21.

Порівнюючи  отримані дані з даними в літературних джерелах, можна стверджувати, що поживне середовище для продуцента P. griseofulvum MTCC 2004 складено вірно. Щодо джерела вуглецю, то вміст глюкози вноситься в середовище в достатній кількості аби забезпечити синтез як біомаси так і цільового продукту. Джерело азоту також відповідає розрахунку. Різниця між літературними даними і обрахунками є у джерела фосфору. В літературі вказана менша кількість дигідрофосфату калію, ніж було розраховано. Це пов’язано з тим, що деякі компоненти поживного середовища розчиняються у водопровідній воді, яка може бути джерелом фосфорних солей.

4.6. Обгрунтування  вибору ферментаційного обладнання.

Penicillium griseofulvum є продуцентом для промислового виробництва антибіотику гризеофульфіну, тобто потреба в антибіотиках є досить високою, тому культивування цього мікроорганізму буде здійснюватись в ферментерів об'ємом 1 м³ з коефіцієнтом заповнення 60 % в умовах глибинного культивування. Отже ці параметри будуть слугувати основою для вибору необхідного ферментера.

Біореактори (ферментери) складають основу біотехнологічного виробництва. Вони призначені для культивування мікроорганізмів, накопичення біомаси, синтезу цільового продукту. Біореактори виготовляють з високолігірованних марок сталі, іноді з титану. Внутрішня поверхня біореактора повинна бути відполірована. Типові ферментери являють собою вертикальні ємності різної місткості (малі – від 1 до 10 л, великотоннажні – більше 10000 л) з мінімальним числом штуцерів і передавальних пристроїв. У біореакторах повинні бути забезпечені оптимальні гідродинамічні і массообменні умови.

Ферментери  забезпечені паровою сорочкою, мішалками, барботерами, стерилізують повітряними  фільтрами, відбійниками, що забезпечують необхідні температурний, газовий  режим, гідродинаміку в біореакторі (тобто процеси масо - і теплообміну).

У біореакторах містяться пробовідбірники для відбору проб культуральної рідини в процесі біосинтезу. Можуть бути й інші конструктивні особливості, що враховують специфіку біотехнологічного процесу.

Тип біореактора, чистота обробки внутрішніх стінок апарату і окремих його вузлів, ємність, коефіцієнт заповнення, поверхня тепловіддачі, спосіб відведення тепла, тип перемішуючих, аеруючих пристроїв, арматура і запірні пристосування, спосіб піногасіння, – далеко не повний перелік окремих елементів, які, в окремо і у взаємозв'язку, впливають на процес культивування мікроорганізмів [4].

Біореактори поділяють  на три основні групи:

1) реактори з  механічним перемішуванням;

2) барботажні  колони, через які для перемішування  вмісту пропускають повітря;

3) ерліфтніреактори  з внутрішньої чи зовнішньої циркуляцією.

Біореактори першого  типу використовують найчастіше, так  як вони дозволяють легко змінювати  технологічні умови та ефективно  доставляти до зростаючих клітинан повітря, що визначає характер розвитку мікроорганізмів  і їх біосинтетичну активність. У таких реакторах повітря подають у культуральне середовище під тиском через форсунку – кільце з безліччю маленьких отворів. Перемішування середовища за допомогою барботеру є недостатнім, особливо для ферментерів об’ємом 4 – 5м³ і більше. Тому аерування і перемішування середовища тільки за допомогою барботеру допустиме лише у випадках, коли вимоги до активності вирощуваної культури не є високими, наприклад в посівних апаратах. При цьому утворюються дрібні бульбашки повітря і за рахунок механічного перемішування забезпечується їх рівномірний розподіл. Для цієї ж мети використовують мішалки – одну або декілька [10].

Мішалки, розбиваючи великі бульбашки повітря, розносять  їх по всьому реактору і збільшують час перебування в культуральному середовищі. Ефективність розподілу  повітря залежить від типу мішалки, числа обертів, фізико – хімічних властивостей середовища.

При інтенсивному перемішуванні культурального середовища відбувається її спінення, тому робочий об'єм біореактора не перевищує 70% загального обсягу. Вільний простір над поверхнею розчину використовують як буферну, де накопичується піна, і таким чином запобігає втрата культуральної рідини. У рідини, яка здатна до більшогоо спінення умови аерації краще, ніж у щільних розчинах (за умови безперервного перемішування і циркуляції шару піни, тобто при виключенні перебування мікроорганізмів поза культуральної рідини). Разом з тим спінення може призвести до перезволоження фільтрів в отворах, через які повітря виходить з біореактора, зменшення потоку повітря і до потрапляння в ферментер сторонніх мікроорганізмів.

Конструктивні особливості барботажних колон  і ерліфтних біореакторів дають цим типам ферментеров деякі переваги перед реакторами з механічним перемішуванням. Барботажние колони більш економічні, так як перемішування в них відбувається вихідними потоками повітря рівномірно по всьому об'єму. Відсутність механічної мішалки виключає один із шляхів проникнення в біореактор сторонніх мікроорганізмів. У барботажних біореакторах не виникає сильних гідродинамічних збурень (зрушень шарів рідини культурального середовища відносно один одного).

Порівнявши  типи біореакторів, доціліше для ції роботи обрати ферментер з механічним перемішуванням барботажного типу. Отже, наступним кроком буде вибір перемішувального пристрою. Основою складністю вибору є узгодження особливостей конструкції мішалки з параметрами технологічного процесу .Важливою умовою під час вибору конструкції мішалки є в'язкість середовища, що перемішується. Зазвичай для малов'язких рідин використовують швидкохідні мішалки, а для високов'язких – тихохідні. Так як поживне середовище не має точно визначеної в'язкості, то можливо розглянути турбінну мішалку, використовується у випадках, коли потрібно створите інтенсивне перемішування, особливо рідин, що значно розрізняються за в'язкістю, а також при диспергуванні газу в рідині. Також вона працює достатньо ефективніше ніж лопатева мішалка. Але в нашому випадку цей параметр можна сприймати за плюс, так як культивуємо гриб, то потрібно забезпечити мінімум стресових ситуацій для нього та забезпечити гомогенне перемішування, щоб уникнути градієнт температури та pH. Саме лопатева мішалка морського типу забезпечуватиме мінімум руйнування гриба. Також лопатеву мішалку доцільно застосовувати для перемішування з метою суспендування, розчинення і під час проведення хімічних реакцій. Вона проста за будовою, що дуже важливим є для застосування у промисловому виробництві. Існують ще так звана якірна мішалки, але для культивування гриба вонає не доцільною, тому що якірна мішалка використовується для запобігання випаданню осаду на стінках і днищі апарата. Також необхідно згадати про рамні та шнекові мішалки, які використуються для перемішування в'язких рідин. Отже, порівнявши мішалки можна зробити висновки, що найкраще перемішування забезпечить лопатева мішалка морського типу, яка буде рухатись при невеликих швидкостях [4, 10].

Ферментер конструкції Гіпромедпрома має циліндричний корпус у якого відношення H/d = 1,8, в апараті розташована двохярусна мішалка, яка оснащена двома відкритими турбінними мішалками. Для попередження биття валу мішалки змонтована нижня опора, для герметизації місця вводу вала мішалки в апарат передбачений торцевий ущільнювач. Стерилізацію ферментера проводять насиченою водяною парою з надлишковим тиском 0,3 МПа ( t = 143 ⁰С). Такого типу ферментер дуже часто використовується в промисловості, з економічної точки зору, ферментер вважається недорогим, але мішалка такого типу може пошкодити міцелій. [4].

Для вибору марки  ферментера розгялянимо ферментер  типу RTY-MS серія ферментатора з лопатевою мішалкою.

Дана серія  ферментера з верхньою механічною мішалкою дозволяє регулювати швидкість обертання мішалки, температуру, PH, розчинення кисню автоматично контролюється. Всі технологічні дані автоматично записуються, архівуються і можуть вивести на друк. Але необхідно зазначити, що він не осначений відбійниками, це зумовить утвореню воронки, яка в свою чергу погіршить якість перемішування. [10].

Розглянемо  ферментер з сухим нагріванням CSLFS-02 виробництва Cleaver Scientific (Великобританія).

Робочі об'єми  препарату 1 м³, 2 м³, 5 м3, 6,3 м³ та 10 м³. Всі частини виготовлені з нержавіючої сталі 316L. Компактний блок управління з вбудованим контролем, насосом і бічною панеллю для підключення допоміжних пристроїв. Можливе зберігання програм. Зберігання 10 файлів процесу моніторингу. Запис даних в режимі реального часу. Передня панель відповідає стандарту ABS. Екран 10.4 (265 мм) кольоровий сенсорний екран з інтерфейсом, стандартним для всіх блоків управління, що дозволяю проводити якісний контроль ферментації та зростання клітин.

Існує система  сухого нагріву з програмованим 15-ступінчастим ПІД-контролером та автоматичний клапан водяного охолодження з контролем на основі соленоїда. Нагрівальна сорочка і охолоджуюча петля.

Перемішування здійснює за допомогою електродвигуна, який може зніматись. Діапазон можливо  варіювати від 30 – 1200 об / хв – стандартний, 5–300 об / хв – для чутливих клітинних культур.

Потрійна регульована  крильчатка Rushton використовується для менш чутливих культур, а подвійна регульована лопатева крильчатка для крихких клітин. Витягнуті відбійники з нержавіючої сталі 316L .

Аерація та потік газу – стандартний вбудований ротаметр повітряного потоку можний також  додатковий модуль для збагачення системи  киснем з ротаметром і клапаном (TMCF за запитом). Барботер використовується стандартний кільцевий з отворами 0,2 мкм. Діапазон pH = 2 – 14, контролюється датчиком по одній точці з регульованою зоною нечутливості заповнений гелем автоклавуємий зонд. Апарат має виносний механічний піногасник. Для охолодження використовують повітря або зовнішнє зрошення.

Підтримує заданий  через автоматичне регулювання швидкості перемішування і швидкості подачі субстрату і додаткове збагачення киснем; якщо швидкість перемішування максимальна, але нижче встановленого значення, активується програма подачі субстрату. Також існує контроль утворення піни, датчик з нержавіючої сталі 316L з ізольованою тефлоновою трубкою [10].

Переглянувши  детальну схему цього ферментера, виявилось що він буде забезпечувати  необхідні умови ферментації  культури порівняно з попередній описаним ферментером.

 

РОЗДІЛ 5

5. Характеритика Penicillium griseofulvum

Сапрофітні  гриби, що не викликають захворювання, але зумовлюють мікогенну сенсибілізацію своїми антигенними компонентами та продуктами метаболізму є гриби  родини Penicillium (від латинського пензлик, кисть) є родом з сумчастих грибів. Займає важливе значення для виробничого процесу, харчових продуктів і ліків [21]. На (рис.7) під світловим мікроскопом при збільшенні в 600 разів чітко видно будову тіла гриба.

Рис.7. Penicillium griseofulvum, збільшення х 600 разів [19].

Розмір геному 10 – 30 · 10⁹ Да. P. griseofulvum належить відділу вищих грибів (Eumycota).

5.1 Морфолого – культуральні  ознаки

Клітина може місти  кілька ядер, запасати поживні речовини (глікоген, трегалозу), клітинна стінка гриба містить близько 80 – 90 % полісахариду у вигляді амінополісахариду хітину. Міцелій складається з сукупності гіфів, які розділені поперечними перегородками. В основному поширення грибів відбувається при утворенні екзогенних коній (кодієспори) [21]. Час, необхідний для формування кодієносців, тобто індукції інтервал становить 7-14 год, а його довжина збільшується з віком гриба [19].

Колонії мають  синє забарвлення з зеленим відтінком (рис.8.) та містяться склероції, для перенесення несприятливих умов. Найвідомішим є те, що цей гриб, є продуцентом гризеофульвіну, який використовується як антибіотик, який вбиває або зупиняє ріст деяких видів бактерій в організмі.

Рис.8. Penicillium griseofulvum на агаризованаму середовищі

P. griseofulvum широко відомий тому що здатний псувати продукти харчування та уражати рослини. Отже він відноситься до фітопатогенних грибів.

5.2 Фізіолого – біохімічні ознаки

Гриби є гетеротрофами, які в якості постачальника енергії та вуглецю використовують органічні сполуки, ростуть в аеробних умовах та позбавлені хлорофілу. В якості джерела вуглецю поживні середовища зазвичай містять лактозу. Лактозу можна замінити легко засвоюваними вуглеводами (глюкозою, сахарозою, галактозою, ксилозою) за умови їх безперервного введення в середовище. Досить часто використовують сахарозу або суміш лактози з глюкозою у відношенні 1:1. У ряді випадків замість кукурудзяного екстракту застосовують арахісове борошно, макухи, борошно з бавовняного насіння та інші рослинні матеріали [1, 19].

Розмір цитоплазматичних рибосом 80S, це означає що більшість антибіотиків не діють і не порушують функцію гриба. Але все ж таки чутливість гриба має місце до полієнових та глутарамідних антибіотиків [21].