Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну

Найбільшою негативною ознакою є те, що P. urticae здатний продукувати широкий спектр мікотоксинів, таких як охратоксину, віоксантин, стільниковий токсин і. шкідливі ефекти цих мікотоксинів можуть вплинути на печінку і нирки сільськогосподарських тварин. В залежності до pH від є дуже чутливим, що дуже ускладнює процес культивування. При незначній зміні pH він утворює велику кількість ліпідів. За продуктивністю продукту – до 2,5 г/л, що не виправдовує затрат на поживне середовище .

В зв'язку з тим що більша частина антибіотика утворюється на ранніх стадіях росту гриба з азотистих запасів міцелію, то утворення білків може бути конкуруючим фактором, що лімітує утворення антибіотику [8, 14].

Було проведено дослідження препарату на ефективність. Ще у СРСР виявили що найбільш активну дію для виготовлення препарату займає Penicillium griseofulvum [7].

В першу чергу  слід відзначити його активність утворення  мікотоксинів, який в процесі розвитку не утворює досить токсичного патуліну. Кільсть патуліну складає від (12,2 до 24,4 мг/кг ^-1). Це означає, що така мала кількість патуліну практично не впливатиме на організм і не викликатиме значних побічних реакцій [20, 21, 22].

На сьогоднішній найкращий  вихід гризеофульвіну забезпечує штам Penicillium griseofulvum МТСС 2004. Порівнюючи вихід антибіотика у Penicillium griseofulvum МТСС 1898 та Penicillium griseofulvum МТСС 2004 при неоптимальних умовах культивування було виявлено, що останній на 1,5 разів стійкий та синтез антибіотику менший на 2 дні.

Також дуже важливим аргументом можуть слугувати високі протеолітичні властивості гриба наявність кукурудзяного екстракту або іншого рослинного матеріалу в середовищі повністю забезпечує продуцент гризеофульфіну азотом. Необхідно зазначити, що розроблений метод направленого культивування який дозволяє вносити NaCl в набагато менших кількостях, порівняно з попереднім штамом, що відбувається на середовищах з 0,1% NaCl [7, 20]. Стимуляція виходу антибіотика спостерігається при добавлені в поживний субстрат тартрата амонія [15].

Вивчено мінливість штаму Penicillium griseofulvum МТСС 2004 за рівнем синтезу антибіотика гризеофульвіну при вирощуванні на повноцінних живильних середовищах. В глибинних умовах після 96 годин культивуння, синтезується антибіотик. Найвищу антибіотичну активність він має на середовищі, коли джерелом вуглецю служить лактоза, вона утилізується грибом повільніше, ніж глюкоза, в результаті чого в період максимального виходу антибіотика лактоза ще міститься в середовищі. Тому стає недоцільним вносити середовище дробно. Звичайно лактозу можна замінити легко засвоюваними вуглеводами (глюкозою, сахарозою, галактозою, ксилозою), але тоді ми повинні інтенсивно слідкувати за процесом культивування та постійно, безперервно вводити їх у середовище [3].

Крім того, Penicillium griseofulvum МТСС 2004 часто зустрічається в грунті теплиць в селекції декоративних рослин, це говорить що гриб легко доступний, тому додкові кошти не потрібно витрачати. [9, 11].

Для кращого виходу продукту в середовище вносять органічні  кислоти та проводять аерацію  культури; максимальне його накопичення відбувається при інтенсивності аерації, близькою до одиниці [21].

Важливу роль у процесі  біосинтезу грає сірка. Продуценти антибіотика  в якості сірки добре використовують сульфати і тіосульфати.

В якості джерел фосфору P. griseofulvum МТСС 2004 може використовувати як фосфати, так і фітати. Це свідчить що можливо без особливих складностей забезчити культуру всіма потрібними сполуками для біосинтезу [1].

Отже, за продуктивністю він знаходиться на вищому рівні ніж попередній штам, вихід антибіотику складає – до 540 г/л. [19].

 

4.3. Обгрунтування поживного середовища для вирощування Penicillium griseofulvum продуцента гризеофульвіну

Для виробничого  вирощування Penicillium griseofulvum MTCC 2004 використовують середовище наступного складу (г/л): кукурудзяного екстракту – 1; глюкози – 11; лактози – 28; KH₂PO₄ – 0,5; NaNO₃ – 3, KCl – 1; MgSO₄ 7H₂O – 0,25; MnSO₄ H2O – 0,02; ZnSO₄ 7H₂O – 0,044 і CaCO₃ 2H₂0 – 1. Культуру інкубували на обертальному шейкері при 160 об / хв і 30 ° C. Зразки були виведені на черговий інтервал 24 год і аналізували на гризеофульвіну

Penicillium griseofulvum MTCC 2004 зберігається  на скошеному агарі зі складом (г/л): сахарози – 30; К₂НРО₄ – 1; NaNO₃ – 2, KCl – 0,5; MgSO₄ 7H₂O – 0,5; FeSO₄ 7H₂O – 0,01; ZnSO₄ 7H₂O – 0,01 і CuSO₄ 5H₂O – 0,005. Фізіологічну активність перевіряють кожен місяць, і зберігся при 1 – 4 ° C [19].

Стимуляція антибіотика спостерігається при добавлені в поживний субстрат тартрата амонія [15].В якості джерела вуглецю поживні середовища зазвичай містять легкозасвоюваний вуглевод, яким в нашому випадку слугує глюкоза. Як друге джерело вуглецю використовують лактозу, наявність якої в середовищі для вирощування гриба бажана з такої причини. Лактоза є обов’язковим компонентом ферментаційного середовища, її споживання починається не відразу, а після деякого періоду адаптації, протягом якого відбувається утворення ферменту, який розчеплює лактозу. Лактоза визнана основним джерелом вуглецю, це пояснюється тим, що лактоза засвоюється більш повільно, ніж глюкоза, внаслідок чого в фазі утворення гризеофульвіну лактоза присутня в середовищі. Необхідності вирощувати посівний міцелій на такому середовищі немає, тому будемо користуватись тільки легко засвоюваними вуглеводами, наприклад глюкозою [3].

Потреба потреба  в азоті легко задовольняється мінеральним азотом – амонійним або нітратним. Крім неорганічного азоту, до складу поживних середовищих, що використовуються в промисловості, входить багатша органічним азотом рослинна сировина – кукурудзяний екстракт. Рослинна сировина характеризується не лише наявністю органічного азоту, вона містить додатковий вуглець. Також важлим компонентом для утворення гризеофульвіну слугує хлор, так як він безпосередньо входить у молекулу антибіотику, його концентрації потрібно забезпечити вищі, ніж для росту гриба. Всі ці фактори сприяють утворенню на комплексних середовищах великої кількості біомаси.

Лактозу можна  замінити легко засвоюваними вуглеводами (глюкозою, сахарозою, галактозою, ксилозою) за умови їх безперервного введення в середовище. Для культивування може бути використане мінімальне поживне середовище такого складу(г/л): глюкози – 40; KH₂PO₄ – 1,52; NaNO₃ – 2, KCl – 0,52; MgSO₄ 7H₂O – 0,52; FeSO₄ 7H₂O – 0,01. На дане середовище не забезпечить достатнього виходу антибіотику, максмильна концентрація гризеофульвіну складає 460 мг/л, а концентрація біомаси складає 14 г/л [23].

Отже, для виробничого  культивування P. griseofulvum MTCC 2004 використовують середовище, яке містить лактозу. Вихід гризеофульвіну складає 540 мг/л, а концентрація біомаси 8 г/л.

Взагальному, вихід  гризеосульвіну на лактозному середовищі підвищується в порівнянні з використанням  сахарози на 15%, а на синтетичному середовищі – на 35% [19].

4.4. Розрахунок складу поживного середовища

Для вирощування  штаму Penicillium griseofulvum MTCC 2004 – продуцента гризеофульвіну використовують поживне середовище зі складом:  кукурудзяний екстракт, глюкоза, лактози, дигідрофосват калію, нітрат натрію, сірчанокислий магній, сірчанокислий манган, сірчанокислий цинк, калвй хлорид, крейда, було отримано максимальну концентрацію антибіотика, яка становила 540 мг/л, концентрація біомаси складає 8 г/л [19].

Розрахунок  вмісту в середовищі джерела вуглецевого  живлення

Потреби для синтезу гризеофульвіну. Як джерело вуглецю для одержання гризеофульвіну використовується лактоза та глюкоза.

Розрахуємо, скільки вуглецю (за елементом С) міститься в 0,54 г гризеофульфіну. Молекулярна маса гризеофульвіну [C₁₇H₁₇O₆ Сl] становить 353. Отже, у 353 г гризеофульвіну міститься 204 г вуглецю, а в 0,54 г гризеофульвіну (204 × 0,54) / 353 = 0,31 г вуглецю.

Далі розрахуємо, у скількох грамах лактози міститься 0,31 г вуглецю. Отже, у 342 г лактози міститься 144 г вуглецюю, тобто 0,31 г вуглецю міститься у (342 × 0,31) / 144 = 0,75 г лактози.

Враховуючи, що при вирощуванні мікроорганізмів  на вуглеводах близько 35% субстрату  окислюється до СО₂ для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму, вміст лактози у середовищі становитиме (0,75 × 0,35) + 0,75 = 1,025 г/л.

Потім розрахуємо, у скількох грамах глюкози міститься 0,31 г вуглецю. Отже, у 180 г глюкози міститься 72 г вуглецюю, тобто 0,31 г вуглецю міститься у (180 × 0,31) / 72 = 0,775 г глюкози.

Враховуючи, що при вирощуванні  мікроорганізмів на вуглеводах близько 35% субстрату окислюється до СО₂ для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму, вміст глюкози у середовищі становитиме (0,775 × 0,35) + 0,775 = 1,046 г/л.

Розрахунок вмісту хлору в середовищі

Розрахуємо, скільки хлору  міститься в 0,54 г гризеофульфіну. Молекулярна маса гризеофульвіну [C₁₇H₁₇O₆ Сl] становить 353. Отже, у 353 г гризеофульвіну міститься 35,5 г хлору, а в 0,54 г гризеофульвіну (35,5× 0,54) / 353 = 0,054 г хлору.

Далі розрахуємо, у скількох грамах калій хлору міститься 0,054 г хлору. Отже, у 74,5 г калій хлору міститься 35,5 г хлору, тобто 0,054 г вуглецю міститься у (74,5 × 0,054) / 35,5 = 0,12 г калій хлору.

Потреби для синтезу біомаси. У біомасі міститься 50% вуглецю, отже вміст вуглецю у 8 г біомаси становить 8 × 0,5 = 4 г. Молекулярна маса глюкози становить 180. Отже, у 180 г глюкози міститься 72 г вуглецю, тоді 4 г вуглецю буде міститися в (180 × 4) / 72 = 10 г глюкози. Враховуючи те, що 35% втрат субстрату витрачається на окислення, для одержання 8 г/л біомаси у середовище необхідно внести (10 × 0,35) + 5 = 13, 5 г/л глюкози.

Розрахуємо кількість  лактози, необхідного для одержання 8 г/л біомаси. Молекулярна маса лактози становить 342. Отже, у 342 г лактози міститься 144 г вуглецю, тоді 4 г вуглецю буде міститися в (342 × 4) / 144 = 9, 5 г лактози. Враховуючи те, що 35% втрат субстрату витрачається на окислення, для одержання 8 г/л біомаси у середовище необхідно внести (9,5× 0,35) + 9,5 = 12,9 г/л глюкози.

Отже, загальний вміст  цукрів в середовищі, необхідний для  синтезу біомаси (11 г/л) та гризеофульвіну (0,54 г/л), становить 13,5 + 12,9 + 1,025 + 1,046 = 28,5г/л.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення

Потреби для синтезу біомаси. Припустимо, що в біомасі міститься     10 % азоту. Таким чином, у 8 г біомаси вміст азоту становить 0,8 г.

Припустимо, що у біомасі міститься 10 % азоту. Таким  чином, у 11 г біомаси вміст азоту (N) становить (8 × 0,10) = 0,8 г.

Кукурудзяний  екстракт є джерелом органічного  азоту, який добре засвоюється. Таким органічним азотом є амінний азот і частково білковий. У ньому міститься близько 50% білків. Для хімічного складу білків характерний постійний середній вміст нітрогену – близько 16%.

Далі розрахуємо, у скількох грамах білку міститься16 г нітрогену.

Отже, у 100 г білку  міститься 16 г нітрогену, тоді 0,8 г нітрогену міститься в (100 × 0,8) / 16 = 5 г білку. У перерахунку на кукурудзяний екстрат отримаємо (100 × 5 / 50) = 1 г/л.

Продуцент гризеофульвіну асимілює як джерела азотного живлення також мінеральний азот. Для одержання  антибіотика в промислових умовах використовується середовище, яке містить як джерело мінерального азоту нітрат натрію – NaNO₃

Розрахуємо  кількість нітрат натрію, необхідну  для одержання 8 г/л біомаси. Молекулярна маса NaNO₃ становить 85. Отже, у 85 г нітрат натрію міститься 14 г азоту (N), тоді 0,8 г азоту буде міститись у (85 × 0,8) / 14 = 2,8 г NaNO₃.

Загальна кількість  азоту складає 2,8 + 1 + = 3,8 г.

Розрахунок  вмісту фосфору у середовищі

У біомасі міститься  близько 3% фосфору (за елементом Р). Отже, для синтезу 8 г/л біомаси вміст фосфору у середовищі повинен становити 8 × 0,03 = 0, 24 г/л. Джерелом фосфору у промисловому виробництві антибіотика гризеофульвіну є дигідрофосфат калію – КН₂РО₄[2].

Далі розрахуємо, у якій скількох грамах КН₂РО₄ міститься 0,24 г фосфору.

Отже, у 140 г –  КН₂РО₄ міститься 31 г фосфору, тоді 0,24 г фосфору міститься в (140 × 0,24) / 31 = 1,08 г КН₂РО₄.

Розрахунок  вмісту магнію в середовищі

У біомасі міститься  близько 0,5 % магнію (за елементом Mg). Отже, для синтезу 8 г/л біомаси вміст магнію в середовищі повинен становити 8 ×0,005 = 0,04 г/л. Джерелом магнію у промисловому виробництві гризеофульвіну виступає MgSO₄.

Отже, у 130 г MgSO₄ міститься 24 г магнію, тоді 0,04 г магнію міститься в (130 × 0,04) / 24 = 0,21 г MgSO₄.

Розрахунок  вмісту кальцію у середовищі

Потреби на синтез біомаси. У біомасі міститься близько 0,5 % Са (за елементом Са). Отже, для синтезу 8 г/л біомаси вміст кальцію в середовищі повинен становити 8 × 0,005 = 0,04 г/л. Джерелом кальцію у промисловому виробництві гризеофульвіну є СаСO₃ .

Отже, у 100 г СаСO₃ –  міститься  40 г  кальцію, тоді  0,04 г кальцію міститься в (100 × 0,04) / 40 = 0,1 г СаСO₃.

Розрахунок  вмісту натрію в середовищі

У біомасі міститься  близько 1% натрію (за елементом Na). Отже, для синтезу 8 г/л біомаси вміст натрію у середовищі повинен становити 8 × 0,01 = 0,08 г/л. Джерелом натрію у виробництві гризеофульвіну є NaNO₃ .

Отже, у 85 г NaNO₃ . – міститься 23 г натрію, тоді 0,08 г натрію міститься в (85 × 0,08) / 23 = 0,3 г NaNO₃ .

Розрахунок  вмісту мангану в середовищі