Получение ферментного препарата амилазы методом поверхностного культивирования

α -Амилаза (α -1,4-глюкан-4-глюкано гидро лаза) является эндоамилазой, вызывающей гидролитическое расщепление α -1,4-гликозидных связей внутри высокополимеризованно го  субстрата. Фермент назван a-амилазо й потому, что  он высвобождает глюкозу в α -мутамерной фо рме.

α -Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина и имеющий молекулярную массу (М.м.) 45 000-60 000. Своего  рода исключением является α -амилаза В. macerans, которая имеет М. м. 130 000. Есть указания, что  некоторые термостабильные α -амилазы имеют М. м. 14000-15000, но  в их молекулах содержится в 2-3 раза больше атомов кальция.

Все α -амилазы относятся к металлоэнзимам, содержание в них Са колеблется о т 1 до  30 г ато м на 1 г мо ль фермента. Полное удаление кальция приводит к инактивации фермента. Повто рно е введение кальция в среду может частично  восстано вить его  активно сть. α -Амилаза В. subtilis с помощью иона цинка способна образовывать димерную форму, чего  лишены другие a-амилазы. Все α -амилазы устойчивы к воздействию протеаз. Они богаты тирозином и триптофано м. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты составляют 25% массы белка. Наличие этих кисло т в α -амилазе связывают с их оса-харивающей способно стью. Так, разжижающие α -амилазы не имеют сульфгидрильных групп, а осахаривающие содержат один остаток цистеина. Сравнительно  мало  или совсем о тсутствуют в α -амилазах содержащие серу аминокисло ты. Некоторые α -амилазы грибного  происхождения имеют углеводный фрагмент, в состав которого могут входить манноза, ксилоза, гексозоамин, но  функции его  не установлены.

В зависимости от вида микроорганизма свойства α -амилаз могут сильно  отличаться не только  по  механизму воздействия на субстрат и конечным продуктам, но  и по  оптимальным условиям для проявления максимальной активности.

Действуя на целое крахмальное зерно , α -амилаза атакует его , разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е. как бы раскалывает зерно  на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с о бразованием на окрашиваемые йодом продукты - в основном состоящие из низкомо лекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия α -амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно  гидролизуются α -амилазо й до  ди- и моносахаридо в.

Все α -амилазы проявляют наименьшее сродство  к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же α -амилазы, особенно  грибного  происхождения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко  с образованием небольшого  количества мальтозы и глюкозы. Схему гидролиза под действием α -амилазы можно  записать следующим образо м:

α -Амилаза

Крахмал----------------> а-Декстрины + Мальтоза + Глюкоза

гликоген (много ) (мало ) (мало )

 

β-Амилаза (α-1,4-глюканмальтогидролаза) - активный белок, обладающий свойствами альбумина. Каталитический центр фермента содержит сульфгидрильные и карбоксильные группы и имидозольный цикл остатков гистидина. β -Амилаза - экзофермент концевого  действия, проявляющий сродство  к предпоследней β -1,4-связи с нередуцирующего  конца линейного  участка амилозы и амилопектина.

В о тличие о т α-амилазы β -амилаза практически не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием мальтозы β -конфигурации, по этому данная амилаза по  аналогии с α-амилазой называется β -амилазой. Если гидролизу подвергается амилоза, то  гидролиз идет полностью до  мальтозы. Незначительное количество  декстринов может образовываться при гидролизе «аномальных» амилоз, так как гидролиз β-амилазой идет только  по  линейной цепи до α-1,6-связей. Если субстратом для   β -амилазы служит амилопектин, то  гидролиз идет в значительно  меньшей степени. β -Амилаза отщепляет фрагмент с нередуцирующего  конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по  20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12  молекул мальтозы. Гидролиз приостанавливается на предпоследней α-1,4-связи, граничащей с α-1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные β -декстрины. Действие β -амилазы на крахмал можно  записать в виде следующей схемы:

 

β -Амилаза

Крахмал----------------> Мальтоза + р-Декстрин

гликоген (54-58%) (42-46%)

 

β -Амилазы проявляют большую стабильность в отсутствие ионов Са2+. Молекулярная масса b-амилазы растений достаточно  высока, она составляет от 50 000 до  200 000. Фермент может состоять из одной или четырех субъединиц до  50 000 каждая. Фермент содержит SH-группы и чувствителен к действию тяжелых металлов. Считается, что  (β -амилаза обладает высоко й способностью к множественно й атаке субстрата.

а-гидролиз амилозы; б-гидролиз наружных ветвей амилопектина (β-декстрин обведен пунктирно й линией)

Рисунок 4- Действие β-амилазы на крахмал

 

Открытие глюкоамилаз, называемых иначе γ-амилазами, амилоглюкозидазами, α-глюкозидазами или така-амилазами В, связано  с исследованием ферментов микроскопических грибов, используемых в производстве спирта.

Согласно  новой номенклатуре глюкоамилаза должна расщеплять лишь α-1,4-связи в поли- и олигосахаридах. Однако  установлено , что  этот фермент расщепляет также α-1,6-глюкозидные связи. Поэтому для глюкоамилазы предложено систематическое название α-1,4-1,6-глюкан-4,6- глюкангидролаза.Таким образом, под рабочим названием глюкоамилазы следует иметь в виду фермент, расщепляющий в крахмале и олигосахаридах α-1,4- и α-1,6-глюко зидные связи. Существование в микроскопических грибах таких ферментов, как олиго - 1,6-глюкозидаза (конечная декстриназа) и изомальтаза, расщепляющих α-1,6- связи,некоторые исследователи ставят под сомнение. Весьма активная глюкоамилаза содержится в микроскопических грибах.

 

 

 

 

1.3 Обзор возможных  способов получения

Получение препаратов амилаз из поверхностных культур. Средой для выращивания продуцентов являются пшеничные отруби с добавлением до  25 % солодовых ростков, увлажненные водой, подкисленной 0,1н раствором серной или соляной кислоты. Выход готовой культуры составляет обычно  от 70 до  80 % массы среды. Продуцентами α- амилазы и глюкоамилазы чаще всего  используются микроскопические грибы A. oryzae, A. awamori, A. niger, R. delemar и др. В Японии при твердофазном культивировании применяют бактерии В. subtilis и В. amylosolvents. Режимы выращивания зависят от физиологии продуцента.

Экстракт из поверхностной культуры может быть использован для получения очищенных амилолитических препарато в путем осаждения ферментов органическими растворителями или нейтральными солями. Амилазы выпадают в осадок почти полностью (93-96 %) при концентрации этанола в растворе 69-72 %, ацетона 60-62 и изопропанола 54-55%. Но  сейчас поверхностная культура не считается перспективным сырьем для производства высокоочищенных амилолитических препаратов.

Получение препаратов амилаз из глубинных культур. В настоящее время в нашей стране для получения амилолитических ферментных препаратов преимущественно  используется глубинный способ культивирования продуцентов. В качестве продуцентов используют грибы рода Aspergillus (A. oryzae, A. usamii, A. batatae), спороносные бактерии, относящиеся к группам В. subtilis - mesentericus, дрожжеподобные организмы родов Endomycopsis, Endomyces и многие другие микроорганизмы.

Источники азота. Выбор сред для каждого  продуцента проводится опытным путем с учетом физиологических потребностей продуцента и условий производства. Например, при изучении факторов, влияющих на биосинтез ферментов, было  показано , что  культура В. subtilis 103 весьма чувствительна к источнику азота в среде (табл. 2.).

 

Таблица 2-Факто ры влияющие на био синтез ферменто в

Исто чник азота	Активность α-амилазы, ед.	рН исходно й среды	рН Культуральной жидкости	Содержание  биомассы, г на 100 мл
Цитрат аммония двузамещаемый	82,8	6,9	7,5	0,84
KN	14,4	6,9	6,1	0,11
N N	0	6,9	4,45	0,26
(N S	0	6,9	4,8	0,40
(N HP	86,4	6,9	5,6	0,80
N Cl	43,2	6,9	7,4	0,40
Казеин	24,0	6,9	7,7	0,80
Пептон	43,2	6,9	7,5	1,00
Кукурузный экстракт	36,0	6,8	7,6	1,00
Глютеин	14,4	7,0	6,8	0,74

Наилучшие результаты согласно  данным К. А. Калунянца и др. (1979) наблюдаются в присутствии двузамещенного  цитрата аммония - 82,8 ед. АС/мл и (NH4)2HP04 - 86,4 ед. АС/мл. Органические источники азота менее эффективны, чем неорганические.

Дополнительное введение азота в виде экстрактов из растительного, животного и микробного материала к (NH4)2HP04 позволяет на 30-40 % повысить продуцирующую способность бактерий и достичь активности 110-114 ед. АС/мл(табл 3.).

Таблица 3-Эффективность источнико в азота

Вариант среды	(N HP	Азотсодержащая добавка	Количество  добавки	рН исходной среды	рН готовой культуральной жидкости	Актив. α-амилаз ед. АС/мл
1	1,0	Пептон	0,9	6,9	7,2	108,4
2	1,0	Кукурузный Экстракт	0,9	6,8	7,3	111,6
3	1,0	Экстракт солодовых ростков	5,0	6,8	6,6	114,0
4	1,2	Кукурузный экстракт и пивные осадочные дро жжи	0,8 и 0,4	6,7	7,2	111,6

Источники углерода. Главным источником углерода в среде для всех продуцентов α-амилазы является крахмал различного  происхождения. Используют чаще всего  крахмал картофельный или кукурузный, который вводится в среду в клейстеризованно м состоянии. Вместо  крахмала может применяться крахмалсодержащее сырье, например ячменная или кукурузная мука. Все эти компоненты используются в нативно м виде или в виде различных гидролизатов.

Установлено , что  биосинтез α-амилазы протекает более интенсивно , если крахмал частично  гидролизовать в процессе приготовления питательной среды, не допуская при этом накопления в среде низкомолекулярных дисахаров (мальтозы) и особенно  глюкозы (табл 4.).

 

Таблица 4-Эффективно сть исто чнико в углеро да

 

Вариант среды	Способ обработки крахмала в питательной среде	рН готовой культуральной жидкости	Активность α-амилазы в КЖ ед. АС/мл	Активность α-амилазы в КЖ % от контроля
1	Гидролизат крахмала при длительности гидролиза τ=10мин	5,70	177,0	158,5
2	Гидролизат крахмала при τ=60 мин	5,65	168,0	150,5
3	Гидролизат крахмала при τ=1,5 ч	5,72	180,0	161,0
4	Гидро лизат крахмала при τ=18 ч	5,68	180,0	161,0

Поэтому, если состав среды предусматривает высокое содержание крахмала, целесообразно  вводить его  порциями по  мере потребления культурой микроорганизма, что  позволяет избежать явления катаболитной репрессии синтеза α - или глюкоамилазы (рис. 4)

1-контроль; 2-дробный режим  введения крахмала в количестве 0,5 %

Рисуно к 4- Влияние дробного  введения крахмала

 

 

2.Особенности получения  амилаз

 

2.1. О боснование  целесообразности использования  биотехнологических приемов в  производстве амилаз

Амилазы для промышленного  применения получают только  биотехнологическими приемами - биосинтезом с помощью микроорганизмов, так как в растениях их содержится в небольших количествах и выделять их экономически не целесообразно.

При биотехнологических приемах используются мягкие режимы выращивания биомассы продуцента и выделение ферментов (амилаз), так как основная масса продуцентов относится к мезофильным микроорганизмам, оптимум роста для которых находится при температуре 28-36°С.

Использование ферментов очень заманчивая вещь. Ведь они по  многим своим свойствам, прежде всего  активности и избирательности действия (специфичности), намного  превосходят катализаторы химические. Ферменты обеспечивают осуществление химических реакций без высоких температур и давлений, а ускоряют их в миллионы и миллиарды раз. При этом каждый фермент катализирует только  одну определённую реакцию.

Биологические катализаторы можно  использо вать также не извлекая их из живых организмо в, прямо  в бактериальных клетках, например. Этот способ, собственно , есть основа всякого  микробиологического  производства, и применяется он издавна.

Разработка способа повышения устойчивости ферментов значительно  расширяет возможности их использования. С помощью ферментов можно , например, получать сахар из растительных отходов, и этот процесс будет экономически рентабельным. Уже создана опытная установка для непрерывного  производства сахара из клетчатки.

 

 

Описание технологических стадий и режимов производства амилолитического  ферментного  препарата:

В последовательность стадий получения ферментного  препарата, содержащего  α-амилазу, представлена на рисунке 5. В настоящее время для получения амилолитических ферментных препаратов преимущественно  используется глубинный способ культивирования.

Продуцентами при данном способе культивирования являются: микроскопические грибы рода Aspergillus (A. Oryzae, A. Ussamii, А. Batatae), спороносные бактерии, относящиеся к группам Bacillus. Subtilis-mesentericus, дрожжеподобные организмы родов Endomucopsis, Endomyces и многие другие микроорганизмы.