Получение ферментного препарата амилазы методом поверхностного культивирования

Существенное влияние на гидролиз крахмала при затирании окозывает концентрация Н-ионов. При высоких значениях pH (6,2-6,5) скорость гидролиза крахмала уменьшается, замедляется фильтрация сусла, а пиво становится менее стойким при хранении. Оптимальным pH при затирании следует считать 5,3- 5,6, чего можно достичь внесением в затор молочной кислоты.

 

 

3. Описание технологической схемы поверхностного культивирования

Взвешенные отруби загружают в бункер (Б1), из которого дозатором (Д1) передают в шнек-стерилизатор (Ш1). Стерилизованная среда поступает в выдерживатель (В), а из него в аппарат для расхолаживания, увлажнения и засева культурой гриба в виде суспензии (А). Конечная влажность засеянных отрубей около 60 %.

Посевную культуру получают выращиванием микроорганизмов в возрастающем количестве в три этапа в лаборатории. Исходную музейную культуру продуцента, находящуюся на твердой агаризованной среде, пересевают сначала на 1-1,5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку (П). Выращивание проводят в термостате до обильного спорообразования. Второй этап осуществляют на той же среде и при тех же условиях, но в колбах (К), содержащих до 100 г рыхлой среды. Аналогичен и третий этап, но здесь выращивание проводится в сосудах (С) с 500 г среды. Расход посевной культуры — 0,5 % к массе воздушно-сухих отрубей.

Подготовленная и засеянная среда механически загружается в одну из растильных камер (РК) для выращивания плесневых грибов в вертикальном слое. Основные технологические операции выполняются на двух ветвях поточной линии: на первой — загрузка и ращение по стадиям, на второй — выгрузка, мойка и стерилизация растильной камеры.

Растильные камеры передвигаются на поточных линиях по рельсам. Растильная камера вмещает 500 кг отрубей в расчете на воздушно-сухие. Количество камер 7, из них 6 всегда загружены, а 1 находится на разгрузке, мойке, стерилизации или загрузке.

Растильная камера представляет собой ящик прямоугольной формы размером 1600 x 1300 x 1620 мм, изготовленный из алюминиевого сплава. Внутри нее имеется 23 вертикальных канала с перфорированными стенками для выращивания гриба; диаметр отверстий 3 мм, шаг 40 мм. Сверху каналы открыты, а снизу закрыты затворами, открывающимися при разгрузке системой рычагов. Щели между каналами шириной 12 мм предназначены для аэрации растущей культуры и отвода выделяемого ею тепла. Кондиционированный воздух подводится с торца камеры и отводится с противоположной стороны. Загруженная растильная камера механическим толкателем продвигается к воздушным диффузорам, которые автоматически с достаточной герметизацией подключаются к растильным камерам. Герметичность создается пневматически.

Наилучшие показатели по активности культуры достигаются при выращивании гриба на среде, температура которой 15 °С. При подаче охлажденного воздуха с относительной влажностью 98-100 %,  подсыхания среды не происходит. Общая продолжительность цикла выращивания культуры с учетом подготовительных и заключительных операций в камере 48 ч.

Сырая культура из растильной камеры выгружается в разгрузочный бункер (Б2), оборудованный специальным устройством для дробления и шнеками (Ш2) подается в сушилку (С). Высушенная культура подается в бункер готовой продукции (Б3), и на упаковку в упаковочную машину (У).

Мойку и стерилизацию растильных камер проводят в камере стерилизаторе, где их обрабатывают водой снизу, сверху и с боков, а затем стерилизуют острым паром при температуре 120 °С. После этого подготовленные растильные камеры с помощью траверсной тележки направляют на загрузку.

 

 

 

Заключение

Микроорганизмы культивируют на средах, богатых углеводами, азотистыми и минеральными веществами, витаминами.

В производстве ферментных препаратов используют синтетические и комплексные среды, являющиеся смесью синтетических сред с естественными материалами растительного, животного и микробного происхождения.

Синтетические среды готовят из различных минеральных солей и органических соединений, являющихся источником углерода — углеводов, спиртов, органических кислот. В качестве естественных материалов применяют отходы пищевых производств: отруби, мелассу, жмыхи, кукурузный экстракт, солодовые ростки, пивные дрожжи, зерно-картофельную барду и др.

Для накопления ферментов в культуральной среде необходимо обеспечить оптимальные условия для их синтеза: состав среды, температуру, значение рН, снабжение клеток кислородом воздуха.

Для нужд пищевой промышленности вырабатываются амилолитические ферментные препараты Амилоризин П10х и Амилосубтилин Г10х. Препараты представляют собой тонкоизмельченные порошки бежевого или светло-серого цвета влажностью не более 13 %. Они хорошо растворимы в воде без постороннего запаха и вкуса. В состав Амилоризина П10х входит комплекс ферментов с превалирующим действием α-амилазы. В качестве сопутствующих имеются протеолитические ферменты, мальтаза, Р-эндополиглюканаза и др.

Стандартные уровни ферментативной активности промышленного ферментного препарата (ФП) Амилоризин П10х составляют, ед/г, не менее: амилолитическая способность (АС) — 2000; осахаривающая способность (ОС) — 1000; протеолитическая активность (ПА) — 30 при рН 4,7...5,4 и температуре 40...45 °С.

Амилосубтилин Г10х представляет собой очищенный ФП, образуемый Вас. subtilis. Препарат содержит α-амилазу, β-глюканазу и протеазу. АС этого препарата не менее 3000 ед/г, а ПА — не более 2 ед/г. Оптимальные для действия Амилосубтилина Г10х условия: рН 6,0.. .6,3; температура 50.. .55 °С. Бактериальная α-амилаза по сравнению с грибной обладает более высокой термостабильностью.

Протосубтилин Г10х отличается высокой протеолитической активностью. Это порошок светло-серого или светло-бежевого цвета с влажностью не более 13 %, характеризуется ПА не менее 70 ед/г.

Протеолитические ферментные препараты используют в мясной промышленности для мягчения мяса, придания ему нежного вкуса и консистенции; в молочной промышленности — для получения гидролизатов белков молока, в пивоварении — для стабилизации пива от помутнения и др.

Применяют два способа выращивания продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный.

Поверхностный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на поверхности твердых, жидких, полужидких или сыпучих материалов. Этот способ создает хорошие условия для максимального контакта микроорганизмов с кислородом воздуха. Его используют в основном при выращивании мицелиальных грибов.

Глубинный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на жидких средах. Этот способ применяют преимущественно при использовании в качестве продуцентов ферментов бактерий и других микроорганизмов, способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом. Он может быть применен и для культивирования аэробных микроорганизмов, какими являются плесневые грибы и некоторые бактерии, но для этого необходимо интенсивно аэрировать среду.

При поверхностном способе культивирования оптимальная температура для развития мицелиальных грибов 28...30 °С, бактерий 32...38 °С, относительную влажность воздушной среды на поверхности субстрата необходимо поддерживать в пределах 60.. .70 %. Обязательным условием этой технологии является аэрация растильной камеры.

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты в определенной последовательности. Так, например, при использовании грибов Asp. orizae максимальное количество амилаз накапливается за 21-30 ч, образование же цитолитических ферментов начинается значительно позже и для максимального накопления этих ферментов требуется увеличить длительность культивирования до 48 ч.

Регулируя состав питательной среды, условия и длительность культивирования, можно достичь превалирующей активности одного фермента в комплексе ферментов препарата.

Температура культивирования зависит от видовых особенностей микроорганизмов и колеблется в широких пределах. Для равномерного распределения клеток по объему аппарата, улучшения их контакта с питательными веществами, обеспечения отвода от клеток продуктов их жизнедеятельности осуществляют перемешивание культуральной среды.

При получении культуры поверхностным способом ферменты из питательной среды экстрагируют водой, отделяют экстракт от твердой фазы, сгущают до концентрации сухих веществ 50 % или высушивают.

При глубинном культивировании отделяют клетки микроорганизмов от культуральной жидкости фильтрацией или центрифугированием. Фильтрат или центрифугат сгущают до концентрации сухих веществ 40 % или высушивают.

Полученные таким образом технические ферментные препараты могут использоваться в жидком виде или в виде порошка.

 

Список использованной литературы

1. Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Усманова А.М., Ицкович Е.Л., Лещинская И.Б. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedius. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента.// Биохимия. 1993. - 58, №12.-С. 1923- 1928.
2. Бахматова И.В., Жарикова Г.Г. Физиолого-биохимические особенности вариантов Bacillus subtilis, образующих амилазу.// Микробиология. -1978. 47, №5. - С. 893 - 899.
3. Бахматова И.В., Жарикова Г.Г. Биосинтез ос-амилазы вариантами Bacillus subtilis-mesentericus.l7 Микробиология. 1979. - 48, №3. - С. 514 -522.
4. Безбородов А.М., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов.// М.: Наука. 1984. - 58 с.
5. Бондарчук А.А., Колтукова Н.В., Василевская И.Я., Бурляй Л.В., Руденко А.В. Питательная среда для выделения протеаз бактерий рода Bacillus.ll Микробиол. журн. 1987. - 49, №3. - С. 110 - 112.
6. Ю.Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов.// М.: Изд-во «Элевар». 2000. - 512 с.
7. Дебабов В.Г. Современные селекционно-генетические методы получения промышленных микроорганизмов.// Ж. Всес. хим. о-ва. — 1982. 27, №6. - С. 968 - 972.
8. Дебабов В.Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. //Кн. 2 в Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. М.: Высш. шк. -1988.-208 с.
9. Егоров Н.С., Лория Ж.К., Ландау Н.С. Протеолитические ферменты микроорганизмов в связи с их фибринолитической и коагулазной активностью.// в кн.: Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. -М.: Наука. 1979. - С. 146 - 197.
10. Захарова И.Я, Павлова И.Н, Коваленко Э.А, Жолнер Л.Г, Квасников Е.И, Тиньянова Н.З, Дрындина Л.П. Получение и характеристика литических ферментов термофильного штамма Bacillus sp. 86.II Микроб, журн. 1984. - 46, №3. -С. 21- 30.
11. Знаменская Л.В, Феоктистова Н.В, Лобашова И.Ф, Краснов С.И, Лещинская И.Б. Регуляция биосинтеза внеклеточных ферментов Bacillus intermedius 3S-19. II Прикл. биохим. и микробиол. 1995. - 31, №4. - С. 412-416.
12. Кислухина О, Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья.// Каунас: Технология. 1997. - 184 с.
13. Кичакова Н.А., Павлова И.Н., Захарова И.Я. Очистка и идентификация амилолитических ферментов Bacillus licheniformis. // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. - 34, №5. - С. 503 - 507.
14. Мосолова О.В., Руденская Т.Н., Степанов В.М., Ходова О.М., Цаплина И.А. Глутамин, аспарагин-специфичная протеиназа актиномицетов.// Биохимия. 1987. - 52, №3. - С. 414 - 422.
15. Нефедова Л.И., Устинников Б.А., Цурикова Н.В., Ермакова Г.Н. Получение активного варианта бактериальной культуры продуцента термостабильной альфа-амилазы.// Хранение и переработка сельхозсырья. - 1996, №2. - С. 42 - 43.
16. Нефедова Л.И., Устинников Б.А., Цурикова Н.В., Ермакова Г.Н., Кичакова H.A. Культивирование продуцента термостабильной альфа-амилазы.// Хранение и переработка сельхозсырья. 1996, №5. - С. 38 -39.
17. Павлова И.Н., Ротанова Т.В., Жолнер Л.Г. Аминопептидаза термофильного штамма Bacillus licheniformisJI Микробиол. журн. -1989.- 51, №2.-С. 47-52.47. Патент РФ №2001103. 1991.
18. Пащенко JT.П., Жеребцов Н., Тареева И.М. Получение и использование гидролизатов пера в технологии хлеба.// Хранение и переработка сельхозсырья. 1997. - №5. - С. 34 - 36.
19. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. // М.: Мир. 1987. - 112 с.
20. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Яровенко В.Л. Роль протеолитических ферментов в повышении активности солода и интенсификации спиртового брожения.// Ферментная и спиртовая пр-сть. — 1981. №3. — С. 27-30.
21. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Устинников Б.А., Яровенко В.Л., Коновалов С.А. Влияние протеолитических ферментов на физиологическое состояние и размножение дрожжей.// Ферментная и спиртовая пр-сть. 1983. - №2. - С. 36 - 39.
22. Римарева Л.В., Милюкова Т.Б. Влияние поверхностно-активных веществ на биосинтез протеаз и амилазы грибом Aspergillus oryzae. // Деп. ВИНИТИ. М,- 1991.-№7.-С. 75.
23. Римарева Л.В. Использование комплексного ферментного препарата Амилопротооризина для гидролиза дрожжевого белка.// Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. - №2. - С. 39 - 40.
24. Руденская Г.Н. Глутамил эндопептидаза микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ.// Биоорг. химия. - 1998. -24, №4.-С. 256-261.