Получение ферментного препарата амилазы методом поверхностного культивирования

Рисунок 5. Схема получения ферментного  препарата

Приготовление посевного  материала. Этапы по лучения посевной культуры следующие: 1) обно вление исходной культуры на агаризованной среде; 2) выращивание культуры продуцента на жидкой среде в колбах на качалке; 3) культивирование продуцента в малом, а затем, если требуется, в большом инокуляторе. Посевная доза при засеве производственной среды составляет 4% по  объему.

Компонентами среды являются: кукурузная мука, крахмал, патока, гидролизаты казеина и дрожжей, древесины, липиды, минеральные соли. (содержание СВ о т 1,5 до  15,5 %, pH о т 3,5- 8,5)

Приготовление питательной среды включает в себя составление композиции для ро ста биомассы и накопления ферментов. В питательную среду входит следующий состав (в %): (NH4)2HPO4 - 0.8; КН2РО 4 -0.1; KNO3 -0.11; кукурузный экстракт - 1. Среду стерилизуют для удаления посторонней микрофлоры при температуре 121 °С в течение 1 часа. Температура культивирования: 26-32 С для грибов, а для бактерий 32-35 С. Режим аэрации: 50- 60 м3/ч м3.

Ферментация - процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмо в. Ферментация - это  комплекс процессов, в который входят рост и развитие клеток, биосинтез ферментов, тепловыделение, транспорт метаболитов в культуральную жидкость. Исходный pH питательной среды 6,5-7,0 поддерживают на оптимально м уровне с помощью мела. Процесс протекает при температуре 35 °С и длительность ферментации составляет 55 -60 ч. На рост и развитие клеток существенное влияние оказывает концентрация питательных веществ в субстрате.

Фильтрация - процесс разделения суспензии с использованием пористых перегородок, которые задерживают твердую фазу суспензии и пропускает ее жидкую фазу. Полученную биомассу продуцента вместе с нерастворимыми частицами среды при необходимости стерилизуют, высушивают и используют на корм животным. Фильтрат культуральной жидк сти нестабилен, он не может хранится и должен немедленно  направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.

Выпаривание - процесс концентрирования растворов путем частичного  испарения жидкого  растворителя. Фильтраты глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм их необходимо  сконцентрировать. Ферменты очень чувствительны к термическо й обрабо тке и нуждаются в мягких режимах концентрирования. При температуре греющего  пара 90-100"С и при температуре кипения 35- 40 С потери активации не превышают 10%.

Сепарирование - разделение под действием центробежных сил. Во  вращающемся потоке на взвешенную частицу действует центро бежная сила, направляющая ее от центра к периферии.

 

=

где Gk - центробежная сила, m-масса частицы, r-радиус вращения, wr -окружная скорость.

Сепарирование применяется, когда концентрация взвешенных частиц в жидкости, их размер не очень велики.

Образовавшийся осадок балластных веществ удаляется из культуральной жидкости, а очищенная жидкость подвергается осаждению.

Осаждение - выделение целевого  продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего  с растворенным продуктом и переводящего  его  в твердую фазу. Широкое распространение, для выделения ферментов из водных растворов, получил метод осаждения этанолом, изопропанолом и ацетоном. Добавление таких реагентов вызывают потерю растворимости белковых молекул, и сопровождается образованием осадка из-за снижения полярно сти среды в присутствии осадителя. В водно й среде энергия притяжения молекул фермента и диполей воды (энергия сольватации) превосходит взаимопритяжение молекул фермента, в связи, с чем образуется устойчивый раствор. При определенной концентрации органического  растворителя энергия сольватации становится меньше энергии связи между диполями воды и молекулами растворителя, так как он обладает более сильной полярностью. В результате сольватная оболочка белковой молекулы разрушается, что  приводит к коагуляции белка. При осаждении 2-2,5 объемами изопропанола активность ферментов в осадках сохраняется на 93-95% от исходной, pH обрабатываемого  раствора 6,5-6,8.

Стандартизация ферментных препаратов. Для получения постоянной активности в препараты вводится наполнитель в определенном количестве, которое зависит от полученно й активности в культуре и препарате. Желательно , чтобы наполнитель по  отношению к ферменту выступал и в роли стабилизатора, а не просто  инертного  соединения. Известно , что  хорошим стабилизатором амилолитических ферментов является хло ристый натрий. С внесением наполнителя в виде 1 % хлористого  натрия показали возможность получения из фильтрата культуральной жидкости и грибно й культуры сухих амилолитических ферментных препаратов с индексом ГЗх. Количество  наполнителя можно  рассчитать по  формуле:

S=

-b

где S - количество  наполнителя, необходимое для получения стандартного  по  активности препарата, кг; а - активность исходного  препарата, ед. ФА/г; b - количество  исходного  препарата, кг; с - стандартная активнсть препарата, ед. ФА/г/

Сушка - удаление влаги из твердых и пастообразных материалов путем ее испарения и отводом образовавшихся паров. Движущей силой этого  процесса является разница давлений насыщенных паров над влажным материалом и в газе (Р = р* -р).

Для обезвоживания ферментных растворов применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При высушивании ферментсодержащих материалов имеется ряд трудностей, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Сушку проводят распылением при мягком режиме (температура теплоносителя на входе 120 - 125 °С и на выходе 55 - 60 °С). Длительность распылительной сушки очень мала, пребывание препарата в сушильной башне ограничивается 5-8с. При соприкосновении массы с теплоносителем влага мгновенно  испаряется, частицы охлаждаются и поэтому, несмотря на довольно  высокие температуры теплоносителя на входе и выходе, препарат не нагревается более 35-40 °С. Потери активности сравнительно  малы (7-10%).

 

2.2. Химический  состав и физико -химические  свойства сырья и полуфабрикатов

Кукурузная мука является самым дешевым продуктом из всех зерновых и ее цена зависит от степени измельчения (помола).

Таблица 5- Химический состав сырья

Содержание	%
Крахмал	67-70
Другие углеводы	10
Белки	12
Глютетелин	30
Зеин	50
Количество  зольных веществ	0,92
Ангидридфосфорной кислоты	45
Окись калия	30
Окись магния	15
Влажность не должна превышать	15

Гидролизаты древесины. Сама древесина является не очень «вкусным» сырьем для микроорганизмов, но  после предварительной обработки - высокотемпературного  кислотного  гидролиза - превращается в гидролизаты. Целлюлоза и пентозаны гидролизуются до  глюкозы и других сахаров. Содержание сахаров зависит от породы древесины и технологии гидролиза и составляет 4-8%. Кроме древесины можно  использо вать для тех же целей различные целлюлозо содержащие сельскохозяйственные отходы (солому, кукурузные кочерыжки, стебли хлопчатника и т.п.).

Дрожжевые гидролизаты в высушенном виде содержат до  52% органического  азота, в основном в виде аминокислот.

Кукурузный экстракт - отход крахмалопаточного  производства, получающийся путем упаривания жидкости от замачивания («настоя») кукурузных зерен (замочная жидкость) с содержанием сухих веществ не ниже 48%. В процессе замачивания происходит ферментный гидролиз белков кукурузы, вследствие чего  около  половины азотсодержащих веществ экстракта представляет собой смесь аминокислот, полипептидов и белков. Экстракт - темная вязкая жидкость, содержит 6,4-8% общего  азота, не более 24% золы. В золу входят фосфор, калий, магний, причем фосфор - до  5%, частично  в связанном состоянии в виде фитина. Имеются также витамины группы В (биотин), ростовые вещества и биостимуляторы. Таким образом, кукурузный экстракт представляет собой хорошую смесь источника питания.

Продуценты. Плесневые грибы рода Aspergillius, видов niger, orizae, usamii, awamori, batatae; рода Rhizopus, видов delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные представители Neurospora crassa и Mucor.

Плесневые грибы очень широко  распространены в природе; основное место  их обитания - почва. Они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело  гриба состо ит из длинных переплетенных нитей сероватого  или белого  цвета, называемых гифами. Гифы распространяются по  поверхности питательного  субстрата, образуя мицелий и частично  врастают в него . Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого  пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие или спорангиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого  образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца имеет булавовидное утолщение, от которого  отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригмотшнуровываются более мелкие круглые клетки - конидии. Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит - в стадию споро - или конидиебразования. Споры и конидии плесневых грибов содержат пигменты, что  и придает зрелым культурам характерную окраску.

Аспергиллы являются типичными аэрофилами, поэтому они могут развиваться только  на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно  аэрируемой среде. Оптимальная температура для большинства аспергиллов 25-30°С, для некоторых - до  35°С. Большинство  грибов при поверхностном культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до  40 °С без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около  65%.

Для питания аспергиллов необходимы азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода кроме моносахаридов, многих олиго - и полисахаридов могут служить спирты и органические кислоты, однако  для накопления амилазы в среде обязательно  должны присутствовать крахмал, декстрины или мальтоза. На средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу грибы амилазы не образуют. Источником азота могут быть белки и их гидро лизаты, аммонийные соли и нитраты.

 

 

 

 

2.3 Особенности  применения продукта в производстве  продуктов питаниямилаза био техно ло гический

Амилазы находят применение почти во  всех областях, где перерабатывается крахмалсодержащее сырьё. Амилазы используются для осахаривания зернового  и картофельного  крахмала. Самым большим потребителем амилолитических ферментов является спиртовая и пивоваренная промышленности, где в настоящее время солод (пророщенное зерно ) успешно  заменяется амилолитическими ферментными препаратами. Эти препараты используются в хлебопечении, а также в крахмалопаточном производстве для получения различных видов паток, глюкозы и глюкозо -фруктозных сиропов. Амилазы используются для улучшения качества концентратов и быстроразвариваемых блюд, большую перспективу представляют амилолитические ферментные препараты для промышленности, изготовляющей моющие средства. Там термостабильные и щелочеустойчивые амилазы могут быть прекрасной биологической добавкой для снятия углеводных загрязнений. Амилазы используются в текстильной промышленности для расшлихтовки тканей и приготовления высококонцентрированных клейстеров крахмала в процессе крашения тканей. В последнее время уделяется внимание использованию амилаз при переработке различных крахмалсодержащих отходов в кормовые белковые препараты. Высокоочищенные амилазы применяются для аналитических целей и в медицине.

В настоящее время большое внимание уделяется разработкам схем по  применению концентрированных ферментных препаратов в хлебопечении. Показано , что  ферментные препараты могут быть широко  использованы в качестве улучшителей хлебопекарных свойств как пшеничной, так и ржаной муки. При добавлении препарата амилоризина П 10х в количестве 0,002-0,004% к массе муки, повышается удельный объём хлеба, существенно  улучшаются физико -механические свойства мякиша, становится более интенсивной окраска корки и более приятным вкус и аромат. Амилолитические препараты из Asp.oryzae и A. awamori оказывают положительное влияние на процесс приготовления заквасок и жидких дрожжей. В связи с улучшением бродильной активности заквасок и жидких дрожжей сокращается продолжительность брожения полуфабрикатов на 25-30 % и длительность расстойки при одновременном улучшении качества хлеба. Нельзя забывать о  том, что  в подавляющем большинстве случаев ферментные препараты представляют собой комплексы большого  числа ферментов. При действии этих комплексов может происходить не только  гидролиз крахмала, но  и гидролиз других компонентов муки. С этой точки зрения весьма нежелательно  присутствие в препаратах активных протеиназ. Отмечено , например, что  протеиназа препарата П 10х Asp. Oryzae оказывает отрицательное воздействие на клейковину муки из мягких пшениц. В то  же время она необходима при переработке муки из твёрдых пшениц, когда воздействие фермента на недостаточно  эластичную клейковину дает положительный эффект. В последнее время обращено  внимание на использование в хлебопечении препаратов, содержащих активную глюкоамилазу. Особая роль отводится препаратам из Asp. Awamori и Rh. Delemar, содержащих малоактивную протеиназу.

В пивоваренном производстве главная задача- получить высокий выход экстрактивных веществ из перерабатываемого  сырья. Основным сырьём здесь является солод. Выход экстракта находится в тесной взаимосвязи с активностью гидролаз, образованных при солодоращении и со  степенью растворения солода. Особенно  велика роль амилаз. Она заключается в максимальном извлечении крахмала из солода и переводе этого  субстрата и сбраживаемые углеводы. Однако  в пивоварении в противоположность спиртовому производству не стремяться осахарить конечные декстрины. Они необходимы в сусле, поскольку в дальнейшем создают полноту вкуса пива, в определенной степени обуславливают его  пеностойкость.

Гидролиз крахмала в сбраживаемые сахара (мальтозу, глюкозу) и конечные декстрины осуществляется в процессе затирания. Основными факторами, с помощью которых регулируют специфичность и интенсивность действия амилаз, являются температура и pH среды. Интервал температур 60- 65 С является оптимальным для образования сбраживаемых сахаров. В интервале температур 70- 75"С происходит быстрый перевод крахмала в экстракт с образованием большого количества декстринов. Регулируя продолжительность эти двух температурных фаз, можно добиваться оптимального соотношения между количеством сбраживаемых сахаров и декстринов, определенной степени сбраживания пива, его высокой коллоидной стойкости и пеностойкости. Важное значение здесь имеет не только активность амилаз солода, но и их различная термостабильность.