Біосинтез ціанкобаламіну штамом бактерії Pseudomonas denitrificans

Біотехнологія може привнести  значні переваги у сферу охорони  здоров'я. Збільшуючи поживну цінність їжі, біотехнологія може використовуватися для покращення якості харчування. Наприклад, зараз створюються сорти рису та кукурудзи з підвищеним вмістом білків. У майбутньому споживачі зможуть скористатися олією із зменшеним вмістом жирів, яку буде отримано з генетично модифікованих кукурудзи, сої, ріпаку.

Вітаміни — органічні сполуки різної хімічної природи, необхідні в невеликих кількостях для нормального обміну речовин і життєдіяльності живих організмів. Багато вітамінів є попередниками коферментів, які беруть участь у ферментативних реакціях. Людина і тварини не синтезують вітаміни, або синтезують у недостатній кількості, тому повинні одержувати їх з їжею. Нестача вітамінів приводить до порушення обміну речовин.

Ціанкобаламін необхіднй  для організму тому що бере участь в біосинтезі багатьох компонентів. В людському організмі ціанокобаламін нагромаджується в печінці, нирках, стінці кишок.

Актуальність  теми. В наш час в Україні модернізація промисловості і науки являється актуальною проблемою в вирішенні якої значне місце відводиться біотехнології.

Однією з  важливих задач модернізації являється  вдосконалення технології отримання  біологічно активних речовин.

Вітамін В₁₂ є цінним лікувальним препаратом який використовується в фармацевтичній промисловості, оскільки він є чинником росту й стимулятором гемопоезу, впливає на функції печінки й нервової системи, активує процеси згортання крові, обмін вуглеводів і ліпідів, бере участь у синтезі різних амінокислот. Застосовується в медицині при лікуванні хворих на такі хвороби, як хронічна анемія, алкоголізм, тривала лихоманка, поліневрит, радикуліт, невралгія (у т.ч. невралгія трійчастого нерва), гіпотрофія, фунікулярний мієлоз, травми периферичних нервів, бічний аміотрофічний склероз, дитячий церебральний параліч, хвороба Дауна. Шкірні захворювання (псоріаз, фотодерматоз, герпетиформний дерматит, атопічний дерматит), а в профілактичних цілях - при призначенні бігуанідів, аскорбінової кислоти у високих дозах, патології шлунка і кишечника з порушенням всмоктування вітаміну B₁₂ (резекція частини шлунка, тонкої кишки, хвороба Крона, целіакія, синдром мальабсорбції), злоякісні утворення підшлункової залози і кишечника , променевої хвороби, стресовий стан і інфекція (при довгостроковому протіканні), дієта, патологія нирок.

Вітамін широко використовується в промисловості, як кормові добавки для тварин, птахів.

Найбільш перспективним  методом отримання ціанкобаламіну є мікробіологічний синтез. Хімічний спосіб зараз не використовується, тому що він дуже складний і включає багато стадій (понад 70), тому він не є актуальним на сьогодні.

Новизна теми

 В даній роботі передбачається використання мутанта Pseudomonas denitrificans М-2436. Цей штам було отримано шляхом мутації, яка зумовленя злиттям протопластів за допомогою кон'югатівної плазміди Inc PI. Такий прийом дозволив збільшити вихід вітаміну в 50 разів ( з 1,2 мг/л до 60 мг/л)[3].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

АНАЛІТИЧНЙ  ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

РОЗДІЛ 1. Структура вітаміну В₁₂ та його роль в природі

Для підтримання  нормальної життєдіяльності організму  крім білків, жирів, вуглеводів, мінеральних речовин і води потрібні вітаміни.

Ціанокобаламін — вітамін В₁₂ (кобаламін). Антианемічний вітамін, необхідний для нормального кровотворення. Відіграє важливу роль у використанні організмом амінокислот та фолацину, в утворенні холіну та нуклеїнових кислот, нормалізації жирового обміну в печінці.

Структура вітаміну B₁₂ було вперше визначено в 1956 році Дороті Ходжкін методом дифракції рентгенівських променів. Це була найбільша органічна молекула, структури якої вдалося визначити методами рентгено-структурного аналізу. Циклічна система вітаміну B₁₂ подібна циклічної системі порфіринів - вона складається з чотирьох пірольних кілець з атомом кобальту в центрі. 
 Вітамін B₁₂ - перша органометалева сполука, виділена з біологічної системи. З неполімерних органічних сполук має найбільш складну будову. Молекула складається з двох майже планарних циклічних структур і лінійної дільниці. Метал 3 + 3 пов'язаний з макроциклом, сильно нагадує порфиринове ядро ​​гема. Це тетрапірольна структура, але має ту особливість, що замість метанових містків, що зв'язують 4 пірольних кільця, кільця А і D безпосередньо пов'язані. Друга кільцева структура - азотистих основ - 5,6-диметилбензимидазол (5,6 ДМБ). 5,6 ДМБ з'єднаний з першої кільцевої системою гетерогенної бічним ланцюгом, що складається з N – аміно – 2 -пропанолу (ізопропанола), етерифікованих фосфатом 3 - мононуклеотид, пов'язаного з основою 5,6 ДМБ Na - глікозидний зв'язком. 

Синтез ціанкобаламіну має відмінності від багатьох класичних ферментаційних процесів тим, що необхідністю вносити в середовище метаболічні попередники синтезуючих продуктів Оскільки 5,6 ДМБ не утворюється мікроорганізмами і він є основною складовою вітаміну тому 5,6-диметилбензимідазол вносять в середовище екзогенно.

Вітамін В₁₂ відіграє важливу роль для організму і бере участь в біосинтезі багатьох складових. Також є В₁₂-залежні ферменти:

В₁₂-коферменти численні й різні. Вони відрізняються тим, що містять два типи лігандів: метильную групу і 5 `-дезоксіаденозіна.

Перетворення  вільного вітаміну В₁₂ в кофермент відбувається в присутності специфічних ферментів і за участю в якості кофакторів ФАД, відновленого НАД, АТФ і глутатіону.

При утворенні 5-дезоксикобаламінового коферменту АТФ піддається незвичайного розпаду з відщепленням трифосфатного залишку за аналогією з реакцією синтезу 5-аденозілметіоніна з метіоніну і АТФ.

Хімічні реакції  за участю В₁₂-коферментів поділяють на дві групи: реакції трансметилювання та ізомеризації. В реакціях першої групи коферменти грають роль проміжних переносників метильної групи. До таких реакцій відносяться, наприклад, синтези метіоніну і ацетату. Гомоцистеїн під впливом метілкобаламіна і тетрагідроілглутаматметилтрансферази в присутності відновленого ФАД і N₅-СН₃-ТГФК перетворюється на метіонін. Метильная група N₅-СН₃-ТГФК переноситься спочатку на активний центр ферменту, потім на гомоцистеїн. До другої групи реакцій відноситься ізомеризація L-метілмалоніл-КоА в сукцинил-КоА.

У птахів зниження вмісту B₁₂, в жовтку яєць призводить до різкого падіння виводимості потомству. При додаванні В₁₂ в корми (10-15 мг / т) приріст поросят збільшується на 10-15%, курчат - до 20%, несучість курей - з 180 до 208 яєць на рік. При додаванні B₁₂ до кормів можна замінити тваринний білок рослинним. Вітчизняна мікробіологічна промисловість випускає вітамін B₁₂ двох марок: А-200 мг / кг, В - не менше 500 мг / кг препарату. 
             Люди отримують вітамін В₁₂ з їжею і не можуть засвоювати вітамін, що виділяється бактеріями кишок. Тварини отримують вітамін В₁₂ з кормом і утилізують вітамін, утворений кишковою мікрофлорою[7].

 

1.  Вплив вітаміну на біохімічні процеси в організмі

Вітамін В₁₂, або ціанкобаламін, - важлива біологічна сполука, активний гематопоетичний фактор ссавців і ростовий фактор для багатьох видів мікроорганізмів і тварин.

Ціанкобаламін має виражену ліпотропну дію, він попереджає жирову інфільтрацію печінки, підвищує споживання кисню клітинами при гострій і хронічній гіпоксії. Вітамін B₁₂ бере участь в процесах трансметилювання, перенесення водню, активує синтез метіоніну. Посилюючи синтез і здатність до накопичення протеїну в організмі, уіаноокбаламін надає також анаболічний вплив. Підвищуючи фагоцитарну активність лейкоцитів і активізуючи діяльність ретикулоендотеліальної системи, ціанкобаламін посилює імунітет. Низький рівень ціанкобаламіну удвічі прискорює розвиток захворювання у людей, хворих на СНІД.

Також вітамін B₁₂ відіграє важливу роль в регуляції функції кровотворних органів: він бере участь у синтезі пуринових і піримідинових основ, нуклеїнових кислот, необхідних для процесу еритропоезу, активно впливає на накопичення в еритроцитах сполук, що містять сульфгідрильні групи.

Від забезпеченості ціанкобаламіном залежить широкий спектр емоційних і пізнавальних здібностей. Підтримка оптимального рівня цього вітаміну сприяє запобіганню депресії, старечого слабоумства й сплутаності мислення, допомагає стримувати розпад розумової діяльності в результаті СНІДу. Вітамін B₁₂ допомагає долати безсоння, а також допомагає пристосуватися до зміни режиму сну і неспання, що пояснюється участю ціанкобаламіну в синтезі мелатоніну. Ціанкобаламін допомагає нормалізувати знижений кров'яний тиск.

В людському  організмі ціанокобаламін нагромаджується  в печінці, нирках, стінці кишок. Всмоктування й засвоєння вітаміну погіршується або зовсім припиняється, якщо немає “внутрішнього фактора” – речовини білкової природи (мукопротеїду), яка виробляється залозами слизової оболонки шлунка і, з’єднуючись із вітаміном, запобігає його руйнуванню в кишках.

Вітамін втрачає  свою активність під дією світла. Неможливість використання в організмі вітаміну В₁₂ виникає в результаті атрофії залізистих клітин дна шлунка.

Глистові інвазії  можуть повністю позбавити організм вітаміну В₁₂.

Стверджували, що вітамін В₁₂ крім дії на сульфгідрильні з'єднання підтримує у відновленому стані інші важливі речовини. Так, Уілл і співр.  встановили, що в плазмі хворих перніциозної анемією вміст аскорбінової кислоти знижений; крім того, при ін'єкції таким хворим аскорбінової кислоти вона швидко окислюється до дегідроаскорбінової. Після лікування вітаміном B₁₂ ці явища зникають, а ін'єкції аскорбінової кислоти ведуть до підвищення її концентрації в плазмі. Чоу і співр.  знайшли, що в печінці щурів з недостатністю вітаміну В₁₂ загальний вміст дифосфопіридиннуклеотида підвищено, але кількість його відновленої форми (ДПН-Н) знижений.

Для застосування у якості лікарського засобу вітамін  В₁₂ отримують методом мікробіологічного синтезу, а також використовують препарати, одержувані з печінки тварин, органу, здатного його депонувати. Ціанкобаламін є високоефективним засобом, що допомагає при злоякісному недокрів'ї, постгеморагічних (залізодефіцитних), аліментарних і інших видах анемії. Призначають його також при променевій хворобі, захворюваннях печінки (хвороба Боткіна, гепатит, цироз), при деяких захворюваннях нервової системи, інфекціях і ін.

Ціанкобаламін бере участь у поділі клітин, що притаманне будь-якій клітині організму. Орієнтуючись лише на один цей факт, можна зробити висновки про важливість ціанкобаламіна для організму людини.

Ціанкобаламін впливає на такі процеси в організмі:

• регенерації фолієвої кислоти при формуванні еритроцитів і оболонок нервових клітин, бере участь в реакціях утворення ДНК;
• Біосинтез метіоніну і серину, бере участь у реакціях синтезу метіоніну як кофактора;
• Синтез нуклеїнових кислот;
• Білковий обмін;
• Біосинтез багатьох ферментів (діолдегідрогеназа, ліцеролдегідратаза, етаноламіакліаза, аденозилкобаламінзалежні мутази, глатаматмутаза, метиілмалоніл-СоА-мутаза, 2-метиленглутаратмутаза, рибонуклеотидредуктаза).

 

1.2. Галузі застосування та потреби на ринку

Оскільки ціанкобаламін  необхідний для нормального функціонування організму людей і тварин, він  використовується у багатьох галузях.

Медицині: Ціанокобаламін застосовується при перніціозній (мегалобластичній) анемії, анемії вагітних, порушеннях кровотворної функції кісткового мозку, при захворюваннях нервової системи (розсіяний склероз, гострий період поліомієліту, радикуліти, каузальгії, фантомний біль), при гострих і хронічних гепатитах, алергічних та шкірних захворюваннях, променевій хворобі, порушення росту й розвитку у дітей.

Підвищуючи  фагоцитну активність лейкоцитів і активізуючи діяльність ретикулоендотеліальної системи, ціанкбаламін підсилює імунітет. Низький рівень ціанкобаламіну удвічі прискорює розвиток захворювання у людей, хворих СНІДом.

Також вітамін B₁₂ грає важливу роль в регуляції функції кровотворних органів: він бере участь в синтезі пурінових і пірімідінових підстав, нуклеїнових кислот, необхідних для процесу еритропоезу, активно впливає на накопичення в еритроцитах з’єднань, що містять сульфгідрильні групи.

Від забезпеченості ціанкобаламіном залежить широкий спектр емоційних і пізнавальних здібностей. Підтримка оптимального рівня цього вітаміну сприяє запобіганню депресії, старечого недоумства і сплутаної мислення, допомагає стримувати розпад розумової діяльності в результаті СНІДу.

 Вітамін  B₁₂ допомагає долати безсоння, а також допомагає пристосуватися до зміни режиму сну і неспання, що пояснюється участю цианокобаламіна в синтезі мелатоніна.

Ціанкобаламін допомагає нормалізувати знижений кров’яний тиск.

 

 Вітамін  B₁₂ є однією з речовин, необхідних для здоров’я репродуктивних органів чоловіків і жінок, так, він здатний коректувати зниження змісту сперматозоїдів в насінній рідині

Фармацевтична промисловість: виробництво лікарських препаратів від анемії, психічних розладів, порушення сну, алкоголізмі і низки інших хвороб.