Біосинтез ціанкобаламіну штамом бактерії Pseudomonas denitrificans

При захворюваннях  печінки (гепатити, цирози) призначають  дорослим по 100 мкг через день протягом  25-40 днів.

При гострій  променевій хворобі, діабетичній невропатії, спру дорослим призначають по 60-100 мкг  щоденно протягом 20-30 днів.

Тривалість  лікування ціанокобаламіном та проведення повторних курсів залежить від перебігу захворювання та ефективності лікування.

Лікування дітей:

При постгеморагічних та залізо дефіцитних анеміях призначають  дітям віком від 3 років по 30-100 мкг 2-3 рази на тиждень. При а пластичних анеміях дітям віком від 3 років вводять по 100 мкг щоденно до настання клініко-гематологічного   покращання. 

Середня терапевтична доза для дітей становить 1 мкг/кг маси тіла щоденно, середня тривалість застосування препарату – 10 діб.

Побічна дія:

 При підвищеній  чутливості до ціанокобаламіну  можуть спостерігатися алергічні  явища, головний біль, запаморочення,  нервове збудження, біль у ділянці  серця, тахікардія.

Протипоказання:

 Застосування  ціанокобаламіну протипоказано при еритремії, еритроцитозі, гострих тромбоемболічних захворюваннях, новоутвореннях, за винятком випадків, що супроводжуються мегалобластичною анемією та дефіцитом вітаміну В12. Дитячий вік до 3 років для   лікарської форми в даній дозі.

Передозування:

 При передозуванні  можливі набряк легень, застійна  серцева недостатність, тромбоз  периферичних судин, кропив’янка,  рідше – анафілактичний шок.

Лікування симптоматичне.

Особливості застосування:

 У випадках  появи побічних реакцій, застосування ціанокобаламіну тимчасово або зовсім відміняють. При необхідності лікування ціанокобаламіном застосування препаратом відновлюють, починаючи з малих доз препарату (50 мкг). При лікуванні ціанокобаламіном проводиться систематичний контроль аналізу крові. У разі тенденції до розвитку лейко- та еритроцитозу дозу препарату необхідно зменшити або лікування тимчасово припинити. Потрібно також контролю вати згортання крові, дотримуючись обережності при схильності до тромбоутворення. З обережністю призначають також хворим на стенокардію, причому в менших дозах (не більше 100 мкг ціанокобаламіну на добу).

Застосування  препарату в період вагітності та годування груддю можливе у випадках, коли очікувана користь для матері перевищує потенційний ризик  для плода та дитини.

Заборонено  керування транспортними засобами та виконання іншої роботи, що потребує підвищеної уваги.

Взаємодія з  іншими лікарськими засобами. Не рекомендується сумісне введення препарату в  одному шприці з вітамінами В₁ і В₆, тому що іон кобальту сприяє руйнуванню інших вітамінів. Слід також враховувати, що вітамін В₁₂, може посилити алергічні реакції, спричинені вітаміном В₁.

Умови та термін зберігання:

 Зберігають  у недоступному для дітей, захищеному  від світла місці при температурі  15-25 º С.

Термін придатності - 2 роки.

Умови відпуску. За рецептом.

Упаковка. По 1 мл в ампулах; по 10 ампул у коробці  або пачці.

Виробник. АТ «Галичфарм».

Адреса. Україна, 79024, м. Львів, вул. Опришківська, 6/8.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Розділ 4. Обгрунтування вибору технологічної схеми.

4.1. Вибір  технології

На сьогоднішній день технологія одержання вітамінів, зокрема вітаміну В₁₂ широко розвивається в багатьох країнах світу, зокрема і в Україні. Це спричинено дефіцитом ціанкобаламіну в організмі людей, що викликає багато захворювань.

Виробництво вітаміну не є  легким ні хімічним способом, ні мікробіологічним, оскільки хімічний спосіб дуже складний і включає багато стадій, а для  мікробіологічного способу потрібно дотримуватись багатьох умов, адже процес виділення цільового продукту відбувається в обмеженому інтервалі температур і тиску, значеннях рН і інших показників.

Обов΄язковою умовою до обладнання мікробіологічної промисловості є дотримання санітарно – гігієнічних норм та уникнення контамінації. Також однією із умов є герметичність ферментаційного обладнання. Враховуючи ці умови мікробіологічне виробництво дозволяє одержати більш якісний та високоефективний, екологічно чистий продукт, ніж хімічне виробництво.

В даний час вітамін В₁₂ в промисловості отримують виключно мікробіологічним шляхом[9].

 

4.2. Аналітичний  огляд способів і методів реалізації  мети виробництва.

Метою будь –  якого технологічного процесу, що враховує властивості продуцента, є одержання максимального виходу цільового продукту з мінімальними затратами під час виробництва.

Технологічний процес охоплює перед ферментаційні  процеси, процес ферментації (виробничий біосинтез) та власне одержання цільового продукту, що включає в себе такі стадії: сепарування клітин, екстрагування водою і фільтрування. Фільтрат упарюють і додатково очищають, після чого проводять кристалізацію вітаміну.

Передферментаційні  процеси складаються з підготовки персоналу, поживного середовища, повітря, ферментаційного обладнання та комунікацій, біологічного агенту. Ці всі процеси зображуються на технологічній схемі як допоміжні роботи.

Підготовка  персоналу включає в себе навчання персоналу, перевірку їх знань, а також дозволяє забезпечувати кваліфікований персонал, який виконує роботу згідно інструкції та додержується всіх норм асептики для того, щоб одержати якісну продукцію, яка буде відповідати вимогам нормативно – технічного документа. Перед початком роботи кожен робітник миє руки з використанням миючого засобу, щоб забезпечити стерильність процесу.

Приготування  миючих та дезінфікуючих засобів  є однією з стадій допоміжних робіт, які використовуються під час  прибирання та миття комунікацій  та ферментаційного обладнання. Для щоденного прибирання використовують синтетичний миючий засіб, який у порівняння з органічними засобами є дешевим та більш доступним. Дезінфікуючий засіб дихлору використовують для генерального прибирання приміщень. Оскільки дихлор на відміну від інших хлорвмісних деззасобів є нешкідливим та недорогим у придбанні.

Для миття комунікацій  та ферментаційного обладнання використовують розчин каустичної соди з концентрацією 2%, вона є найкращим миючим засобом, гарно змивається після ополіскування. Потім відпрацьований розчин видаляється і відводиться на знешкодження.

Для герметизації фланців і вентилів застосовують особливі прокладки з пароніту, обробленого  графітом, для герметизації кришок апаратів використовують шнур з прогумованої тканини діаметром до 19 мм, а для завантажувальних люків – гуму завтовшки 14  мм. Перевірку на герметичність здійснюють для того, щоб зберегти той рівень стерильності, який отримали під час стерилізації ферментаційного обладнання. Навіть найретельніша стерилізація ферментаційного обладнання і комунікацій, яку проводять для того, щоб уникнути контамінації та забезпечити чистоту процесу ферментації, не може забезпечити стерильність обладнання, якщо порушено його герметичність.

Продуцент Pseudomonas denitrificans є аеробним мікроорганізмом і під час культивування потребує джерела повітря, яке має бути стерильним, тому для цього його очищають у головному та індивідуальному фільтрі від контамінуючої мікрофлори.

 

 

4.3. Обгрунтування  вибору біологічного агенту

Мікробіологічний синтез виступає сьогодні як складова і найважливіша частина сучасної біотехнології. Майже всі основні досягнення біотехнології отримані прямо чи частково за участі мікроорганізмів чи продуктів їх обміну.

В даний час  в промисловості використовують в основному три штами бактерій: Pseudomonas denitrificans, представників роду Propioni-bacterium і метаногенних бактерії (змішану культуру). У всіх випадках незалежно від використовуваного штаму і умов культивування в середовище вводять іони кобальту і часто 5,6 ДМБ. Додавання таких попередників корріноідів, як гліцин, треонін, 6-АЛК і амінопропанол, може надавати стимулюючу дію на вітаміноутворення.

Мікробіологічний  синтез проходить шляхом культивування продуцентів з попередником. Попередникам є 5,6 ДМБ, який вносять в середовище екзогенно.

Переваги у  використанні бактерії Pseudomonas denitrificans як продуцента ціанкобаламіну в наступному:

- вихід продукту за допомогою цієї бактерії є найбільшим в порівнянні з іншими продуцентами. Для синтезу вітаміну В₁₂ використовують мутант P. denitriflcans, у якого в результаті мутагенезу рівень вітаміну В₁₂ вдалося підняти з 0,6 мг / л (дикий штам) до 60 мг / л. ;

-   бактерія розповсюдженна в природі ( є в повітрі, грунті, морських і прісних водоймах, стічних водах та мулі, нафти і на газових родовищах);

-   час синтезу вітаміну є менший, ніж в пропіоновокислих бактерій і проходить менше стадій;

-  росте на доступних субстратах за близького до нейтрального рН ( рН=7,0-7,2, а в метаногенних бактерій – 5,0-5,2);

- бактерія росте в широкому діапазоні температур і тому досить легко дотримуватись основних вимог щодо вирощування даного виду мікроорганізму;

-  органічних факторів росту не потребують, тому легко врощувати.

Саме тому ми можемо говорити, що біологічний агент вибраний правильно, адже він дозволяє виробляти цільовий продукт з меншими затратами ресурсів, часу та коштів, а також є більш екологічно безпечним, ніж наприклад використання будь-якого іншого агенту і утворювати велику кількість вітаміну, порівняно з іншими продуцентами.

Але прогрес не стоїть на місці, проводять нові досліди і  відкриття і все може змінитися з відкриттям нових мікроорганізмів.

 

4.4. Обгрунтування вибору складу поживного середовища

Для синтезу  всіх клітинних компонентів мікроорганізмам  потрібні поживні речовини − розчинні у воді сполуки, з яких мікроорганізми будують свою клітину. Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, повинні відповідати таким мінімальним вимогам: в них повинні бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, причому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати. До складу бактеріальної клітини входять такі елементи, % до маси сухої речовини: вуглець — 50; кисень — 20; азот — 10 -14; водень — 8; фосфор — 3; сірка, калій, натрій — 1; кальцій, магній, хлор — 0,5;  залізо — 0,2;  решта елементів — близько 0,3 [20].

Продуцент – бактерія Pseudomonas denitrificans.

Вирощування культури ведеться на поживному середовищі, що містить: цукробурякову мелясу, дріжджовий екстракт, (NH₄)₂НРО₄, MgS0₄, MnS0₄, Co(NO₃)₂, 5,6 ДМБ, ZnSO₄, Na₂MoO₃, воду водопровідну.

Меляса багата бетаїн та глутамінової кислотою, що надають  позитивний ефект на вихід вітаміну. ​​Бетаїн стимулює синтез б-АЛК і, можливо, також змінює проникність мембрани. Як джерело вуглецю засвоює сахарозу, бетаїн, не засвоює глюкозу, асимілює глутаминову, пропионову кислоти, тому в нашому випадку джерелом вуглецю є меляса.

Фосфору у середовищі міститься близько 1%, він входить у складі (NH₄)₂НРО₄, фосфор входить до складу головних біоелементів, являється компонентом нуклеїнових кислот, фосфоліпідів і нуклеотидів.

Також середовище містить близько 1% Mg, який являється кофактором ферментів, присутній у клітинних стінках, мембранах та ефірах фосфорної кислоти.

У середовищі міститься  азот, який входить до складу Co(NO₃)₂ і (NH₄)₂НРО₄. Дріжджовий екстракт – виступає фактором росту, як повноцінний та дешевий субстрат. Отже поживне середовище для культивування Pseudomonas denitrificans містить всі необхідні елементи, з яких будується клітина, причому в доступній для засвоєнням організмом формі. Такими основними компонентами є джерело вуглецю та енергії, джерела мінеральних сполук ( азот, фосфор, сірка, магній ), а також фактор росту.

Як посівний матеріал використовують агаризоване середовище з мелясою[17].

4.4.1. Розрахунок складу поживного  середовища

Скласти базове поживне середовище для вирощування ауксотрофного штаму Pseudomonas denitrificans – продуцента ціанкобаламіну якщо за 90 год культивування концентрація ціанкобаламіну в культуральній рідині становить 60 г/л, а концентрація біомаси – 45 г/л.

Розрахунок  вмісту в середовищі джерела вуглецевого  живлення.

Як джерело  вуглецю для одержання ціанкобаламіну використовується меляса.

Розрахуємо, скільки  вуглецю (за елементом С) міститься  в 60 г В₁₂. Молекулярна маса ціанкобаламіну (С₆₃Н₉₀О₁₄N₁₄РСо ) становить 1355. Отже, у 1355 г ціанкобаламіну міститься 756 г вуглецю, а в 60 г  (756×60)/1355=33,5 г вуглецю.

Далі розраховуємо, у скількох грамах меляси міститься 33,5 г вуглецю, враховуючи, що вміст вуглецю у цурках меляси становить 40%. Отже у 100 г цукрів міститься 40 г вуглецю, а у 33,5 мг вуглецю міститься у (33,5×100)/40=84 г цукрів.

Для одержання 60 мг ціанкобаламіну, вміст глюкози у середовищі повинен бути 84×2=168 г/л або 16,8%. Враховуючи, що при вирощуванні на вуглеводах, в нашому випадку на мелясі, близько 40% субстрату окислюється до СО₂ для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму, вміст меляси у середовищі становитиме (168×0,4)+168=252 г/л=25,2%.