Біосинтез ціанкобаламіну штамом бактерії Pseudomonas denitrificans

Допоміжна сировина

Спирт етиловий ректифікований 96%	ДФУ доп.1,ст. 339	Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість, кислотність або лужність, домішки	Для обробки  обладнання та устаткування
Пероксид водню	ГОСТ 177-88Е	Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість	Для потреб робочого персоналу
Каустична сода	ГОСТ 2263-79	Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість	для миття технологічного обладнання, приміщень, інвентарю
Дезактин	ГОСТ 12.1.007	Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість	Для дезінфекції технологічного обладнання

 

 

6.4. Опис технологічного процесу

ДР.1 Санітарна підготовка персоналу

ДР.1.1.1. Навчання персоналу

Персонал, який працює на біотехнологічному виробництві, проходить навчання для кваліфікованого  виконання своїх обов'язків. Інструкція проводиться 1 раз на рік. Під час навчання детально обговорюється концепція забезпечення якості продукції, підготовка та проведення технологічного процесу.

ДР.1.1.2. Перевірка знань персоналу

Після проводження  інструктажу проводиться перевірка  знань персоналу.

Робітник повинен  приготувати поживні середовища, розчини реактивів, установити орієнтувальні  титри, виконати монтаж колб для засівання  спорового матеріалу. Приготувати  посівний матеріал. Розмістити устаткування, провести фармакологічну перевірку і випробувати препарати та напівпродукти на токсичність і пірогенність під керівництвом лаборанта вищої класифікації.

ДР.1.2. Приготування миючих розчинів

ДР.1.2.1. Дезинфікуючий розчин дезактину

Застосовується  для генерального прибирання приміщень, для обробки використовують 0,5 % розчин дезактину.

Матеріали: вода, р-н дезактину приготований заздалегідь.

ДР.1.2.2. Дезинфікуючий розчин перекису водню

Використовують для потреб робочого персоналу. Він є достатньо ефективним і недорогим.

Приготування 3% розчину пероксиду водню.

ДР.1.2.3. Підготовка розчину каустичної соди

Використовується  для ручного миття технологічного обладнання, приміщень, інвентарю 0,5% розчином з температурою 40°-50°С, циркуляційного промивання комунікацій та обладнання 1-2% розчином з температурою 50°-60°С. Готують у полімерних або нержавіючих ємкостях  (неприпустимо застосування ємностей з алюмінію, тому що каустична сода викликає його корозію).

ДР.1.3. Підготовка приміщень

Виробничі приміщення повинні мати між собою технологічний  зв’язок і розташовуватися за ходом технологічного процесу, не допускаючи перехрещення потоків сировини та готових виробів, чистого та використаного посуду, а також повинні бути створені відповідні умови для дотримання виробничої та особистої гігієни працюючим персоналом.

Для дотримання чистоти у виробничих приміщеннях  встановлюють металеві або педальні бачки з кришками, а також корзини  із полімерних матеріалів для збору  санітарного браку та сміття. Бачки  та корзини повинні щоденно очищатися, промиватися та дезінфікуватися дезінфікуючими засобами.

Забороняється зберігати у виробничих приміщеннях  миючі, дезінфікуючі засоби, відходи, інвентар, які не мають безпосереднього  відношення до виробничого процесу. Зберігання протирального інвентарю, миючих та дезінфікуючих засобів здійснюється в окремих приміщеннях. Інвентар (відра, щітки тощо) повинен бути маркірований і закріплений за виробничими, допоміжними і підсобними цехами.

ДР.1.3.1. Щоденне прибирання приміщень

Щоденне прибирання поділяється на:

• підтримуюче, яке проводиться під час робочого часу,
• основне прибирання всього приміщення після закінчення або до початку робочого дня.

Щоденне прибирання приміщень проводять після кожної зміни вологим способом: із приміщень  видаляють готову продукцію, напівпродукти, відходи виробництва, невикористані матеріали.  Вологе прибирання приміщень проводять миючим засобом, цим же розчином миють підлогу. Особливо дуже ретельно протирають дезрозчином ручки і нижні частини дверей. Обробку ведуть в гумових рукавичках, чоботах, фартусі. Зовнішні двері промивають по мірі необхідності, але не рідше 1 разу в тиждень. Вологе прибирання приміщень проводять за 1,5-2 години до початку роботи або за 30 хвилин до закінчення роботи.

Після закінчення вологого прибирання для знезараження повітря вмикають настінні або настельні бактерицидні лампи встановлені з розрахунку 2,5 Вт на 1м³ приміщення (за відсутності людей)  та за 30 хвилин до початку роботи – виключити їх. Кількість ламп розраховують, виходячи із загальної площі і об’єму приміщення. Про заміну і режим роботи ламп ведуть запис в журналі.

ДР. 1.3.2. Генеральне прибирання приміщень

Генеральне  прибирання приміщень проводять 1 раз  на  5 днів (в день профілактики обладнання) або негайно на вимогу бактеріолога у випадку виявлення мікробної  контамінації. Для обробки використовують 0,5 % розчин дезактину. Перед обробкою обезточують все обладнання та електроприлади. Стелю, стіни, двері, вікна, перегородки та обладнання оброблюють шляхом зрошення із гідропульта.         Після закінчення зрошення приміщення закривають на 30-40 хвилин, після чого залишки дезактину видаляють шляхом протирання чистою безворсовою серветкою. Для знезараження  повітря після генерального прибирання вмикають бактерицидні лампи. Проводиться прибирання і наведення порядку в шафах, стелажах.

Матеріали: вода, р-н дезактину приготований заздалегідь.

ДР.1.4. Підготовка обладнання та комунікацій

ДР.1.4.1. Підготовка ферментера

У підготовку ферментера входить миття ферментера і апаратури  проводять розчином каустичної соди за температури 70 - 80˚С. При цьому  у ферментері проходить інтенсивне перемішування. Відпрацьований розчин видаляється і відводиться на знешкодження.

ДР.1.4.1.1. Технологічний огляд обладнання

ДР.1.4.1.2. Миття

Миття ферментера і апаратури проводять розчином каустичної соди за температури 90˚С. При цьому  у ферментері проходить інтенсивне перемішування. Відпрацьований розчин видаляється і відводиться на знешкодження.

 

 

ДР.1.4.1.3. Перевірка на герметичність

Герметичність з'єднань проводять під надлишковим  тиском пари 0,15 – 0,2 МПа. Всі вентилі перевіряють гідравлічним тиском 0,3 МПа Для герметизації фланців і вентилів застосовують особливі прокладки з пароніту, обробленого графітом, для герметизації кришок апаратів використовують шнур з прогумованої тканини діаметром до 19 мм, а для завантажувальних люків – гуму завтовшки 14 мм. Нещільність в фланцевих з'єднаннях, зварювальних швах знаходяться за допомогою мильної води. Знайдені пропуски усувають і проводять повторну перевірку.

ДР.1.4.1.4. Стерилізація

Стерилізація апаратів і комунікацій має велике значення. Для підвищення ефекту стерилізації під час конструювання апаратів варто зменшити кількість зварювань, збільшити діаметр і зменшити висоту штуцерів відведення і підведення.

Стерилізація  проводиться під тиском 0,2 МПа, температурою 150˚С і триває 1,5 – 2 год.

ДР.2. Підготовка стерильного технологічного повітря

Повітря, яке  використовується для аерації у  процесі культивування посівного  матеріалу в посівному апараті  та в процесі біосинтезу в ферментері повинно бути стерильним та мати температуру 30 - 35˚С.

Перед тим, як повітря  потрапляє до ферментеру, воно проходить  часткову очистку, в результаті якої звільняється від мікроорганізмів  під час грубої очистки і повністю очищається від мікроорганізмів  під час тонкої очистки. В ферментер очищене повітря подається через барботер.

ДР.2.1. Забір атмосферного повітря

Забір атмосферного повітря проводиться за допомогою  централізованої повітрозабірної  труби. Повітря збирають з висоти 30 м.

ДР.2.2. Очищення повітря на фільтрах грубої очистки

ДР.2.3. Стиснення повітря

Стиснення повітря  відбувається при температурі 250 ˚С і під тиском 2,3 МПа.

ДР.2.4. Охолодження стисненого повітря

Стиснене повітря  охолоджується поданням охолодженої  води до температури 30-40 ˚С.

ДР.2.5. Очищення на фільтрах тонкої очистки

ДР.2.6. Очищення на фільтрі індивідуальної очистки

ДР.2.7. Стерилізація повітря

ДР.3. Підготовка та стерилізація поживного середовища

Перед приготуванням  поживного середовища усі компоненти  зважують, розчиняють, після чого поживні середовища стерилізують. Всі компоненти стерилізуються в різних умовах в залежності від природи речовин. Дозування проводять за допомогою спеціальних дозаторів. Середовища готуються в апаратах, оснащених мішалкою, куди завантажуються компоненти у відповідній послідовності.

Pseudomonas denitrificans вирощують на поживному середовищі такого складу, г:

      - цукробурякова меляса - 100 ,

      - дріжджовий екстракт - 2 ,

      - (NH₄)₂НРО₄ - 5 ,

      - MgS0₄ - 3 ,

      - MnS0₄ – 0,2, 

      - Co(NO₃)₂ – 0,18,

      - 5,6 ДМБ – 0,025 ,

      - ZnSO₄ – 0,020,

      - Na₂MoO₃ – 0,005,

     - вода водопровідна - до 1 л.

 

Для посіву використовують інокулят, отриманого при вирощування культури на середовищі, що містить, г:

   - цукробурякова меляса - 60,

   - пивні дріжджі - 1,

   - NZ-амін - 1,

   - NН₄НРО₄ - 2,

   - MgSO₄ - 1,

   - MnSO₄ – 0,2,

   - ZnS0₄ -0,020,

    - MoSO₄ – 0,005,

    - агар – 0,25,

       - вода водопровідна - до 1 л

 

 

ДР.3.1. Дозування компонентів поживного середовища

ДР.3.2. Приготування розчину меляси

Стерилізують  окремо і вносять у середовище перед посівом. Стерилізують при температурі 112˚С, впродовж 1 год, тиск 0,5 МПа .

   ДР.3.3. Приготування дріжджового екстракту та його стерилізація

Дріжджовий екстракт готують у вигляді розчину. Стерилізують при температурі 112˚С 1 год, тиск 0,5 МПа.

ДР.3.3. Приготування розчинів фосфорних солей та їх стерилізація

Фосфорні солі стерилізують окремо, для запобігання  випадання осаду. Стерилізацію проводять при температурі 130˚С і тиску 0,15 МПа. Добавляють їх у колби до основної частини ферментаційного середовища.

ТП 4. Підготовка посівного матеріалу

ТП 4.1. Введення музейної культури

Для ферментації  використовують музейні культури штаму Pseudomonas denitrificans на початковій стадії підготовки матеріалу все починається з пересіву культури на щільні середовища для перевірки її фізичних властивостей, біосинтетичної здатності та виявлення неконтрольованої мутації.

ТП 4.2. Вирощування культури в колбах на качалці

Ферментацію здійснюють на круговій качалці в колбах Ерленмейєра. На першій стадії накопичується біомаса,а на другій, яка починається після внесення в середовище попередників, розмноження культури припиняється і відбувається синтез ціанкобаламіну.

ТП 4.2. Культивування поживного середовища в ферментері

Культивування відбувається в ферментері при температурі 32˚С, рН 6,0 впродовж 10 годин.

 

ТП.5 Виробничий біосинтез

ТП.5.1 Виробниче культивування

Після інокуляції розчин стерильно подається у  ферментатор, де безпосередньо проводиться процес культивування. Ферментацію проводять глибинним способом при температурі 32˚С, рН = 7 – 7,2, культивування триває 90 год. Після цього культуральна рідина подається в збірник для подальшої очистки.

 

6.4 Контроль  виробництва

Для забезпечення відповідності готової продукції на підприємстві забезпечується контроль процесу та контроль готової продукції.

Контроль посівного  матеріалу.

Споровий посівний матеріал перед використанням у  виробництві піддають мікробіологічному  і біохімічному контролю. Перевіряють мікробіологічну чистоту, морфологічну однорідність, здатність до спороутворення, кількість в 1г посівного матеріалу, а також активність до біосинтезу коферментів.

Для контрольної  перевірки від кожної партії відбирають спори в кілька прийомів, середню пробу в кількості 1% загальної маси. За результатами контролю середньої проби судять про якість всієї партії.

Партією вважається кількість спор, вирощених одночасно  і оформлених одним документом.

Мікробіологічний  контроль:

Служить для встановлення мікробіологічної чистоти та морфологічної однорідності посівного матеріалу і здійснюється методом розливу спорової суспензії на чашках Петрі з сусло–агаром (СА), м'ясо–пептонним агаром (МПА).

Для аналізу  беруть наважку спор до 35 мг і висівають на 80-90 чашках Петрі з СА і 10-20 чашках з МПА. Випробуваний споровий матеріал розводять так, щоб густина зростання була не менше 40-60 копій на чашку.

Чашки з СА витримують у термостаті при 32˚ С 1-2 доби. На 4 і 6-у добу після посіву чашки  переглядають, визначаючи однорідність (відсутність форм мінливості штаму) і чистоту культури (відсутність дріжджів і кольорової цвілі). При виявленні неактивних форм мінливості штаму більш ніж на 0,2 % або сторонньої мікрофлори посівний матеріал бракується.