Біосинтез ціанкобаламіну штамом бактерії Pseudomonas denitrificans

У промисловості : У птахів зниження вмісту B₁₂, в жовтку яєць призводить до різкого падіння виводимості потомству. При додаванні В₁₂ в корми (10-15 мг / т) приріст поросят збільшується на 10-15%, курчат - до 20%, несучість курей - з 180 до 208 яєць на рік. При додаванні B₁₂ до кормів можна замінити тваринний білок рослинним. Вітчизняна мікробіологічна промисловість випускає вітамін B₁₂ двох марок: А-200 мг / кг, В - не менше 500 мг / кг препарату. 
Люди отримують вітамін В₁₂ з їжею і не можуть засвоювати вітамін, що виділяється бактеріями кишок. Тварини отримують вітамін В₁₂ з кормом і утилізують вітамін, утворений кишковою мікрофлорою.

Вітамін В₁₂ має важливе значення для роботи людського  організму і тварин : впливає на кровотворчу функцію і на обмін білків, бере участь в регуляції оптимального вмісту в організмі тварини метіоніну, валіну, треоніну, лейцину, ізолейцину.З 10 тонн, що щорічно випускається в світі вітаміну B₁₂, з яких 6,5 т витрачають на медицинські потреби, а 3,5 т в тваринництві[4].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 2. Порівняльна характеристика методів  одержання і промислових способів виробництва вітамінів

Хімічний синтез вітаміну В₁₂ дуже складний. Він включає 70 стадій. Тому в даний час вітамін В₁₂ в промисловості отримують виключно біосинтетичним шляхом. З 10 тонн, що щорічно випускається в світі вітаміну B₁₂ - 3,5 т припадає на ціанкобаламін (власне вітамін B₁₂).

Для промислового отримання вітаміну використовують метаногенні, пропіоновокислі бактерії і бактерію роду Pseudomonas denitrificans. Найкращим продуцентом вітаміну є псевдомонада, тому що вихід вітаміну за допомогою цієї бактерій є найбільшим, поживне середовище для вирощуванням не складним, бактерія розповсюджена в природі.

Порівняно з  пропіоновокислими і метаногенними  бактеріями, час культивування є менший.

Однак синтез на основі метаногенних бактерій є економічно доцільнішим, оскільки ці бактерії містяться  в спиртовій барді, що є відходом виробництва, тому можна отримвати вітамін з відходів, але вихід продукту є малим (2 мг / л).

Якщо брати  до уваги пропіоновокислі бактерії то є штами, які самостійно синтезують 5,6 ДМБ, що є дуже вигідним, однак процес біосинтезу ціанкобаламіну триває дуже довго.

 

2.1. Джерела  отримання вітаміну В₁₂

2.1.1. Мікробний синтез 

Найбільш перспективним  методом отримання ціанкобаламіну є мікробіологічний синтез.

Найкращим продуцентом  є бактерія Pseudomonas denitrificans. Вирощування продуцента відбувається на середовищах, які містять мелясу, дріжджовий екстракт, фосфати, солі магнію, мангану, кобальту,цинку і, обов’язково, 5,6-диметилбензимідазол, який є попередником вітаміну В₁₂. 5,6-ДМБ вносять в середовище екзогенно. В процесі вирощування вітаміну використовують 2 поживні середовища. Однак в кінцевому результаті утворюється не чистий вітамін В₁₂, тому проводять ряд послідовних операцій, щоб отримати чистий вітамін.

Також використовують такі бактерії, які продукують ціанкобаламін:

Утворення  вітаміну В₁₂ різними штамами:

Штам	Джерело вуглецю	Вихід, мг/л
Micromonospora sp. Nocardia rugolaa	глюкоза	11,5
Propionibacierium freudenreichii	глюкозо-очеретяна  меляса	14
Propionibaderium khermanii	глюкоза	25
Propionibacterium vannielii	глюкоза	23-40
Pseudomonas denitrificans	цукробурякова меляса	60
Streptomyces olivaceus	глюкоза	35
Bacterium FM-O2T	глюкоза	2,6
Methanobacillus omelianskii	лактоза	8,8
Protaminobacter ruber	метанол	2,5

Таблиця 2.1. Утворення  вітаміну В₁₂ різними штамами

У табл. 2.1. наведені мікроорганізми, які в силу високого рівня біосинтезу кобаламіну в різний час розглядалися як його потенційні продуценти в промисловості. В даний час в промисловості використовують в основному три штами бактерій: Pseudomonas denitrificans, представників роду Propionоbacterium і метаногенних бактерії (змішану культуру).У всіх випадках незалежно від використовуваного штаму і умов культивування в середовище вводять іони кобальту і часто 5,6 ДМБ. . Додавання таких попередників корріноідів, як гліцин, треонін, 6-АЛК і амінопропанол, може надавати стимулюючу дію на вітаміноутворення[2].

 

2.1.2. Хімічний синтез

Оскільки хімічний спосіб виробництва ціанкобаламіну дуже складний і включає багато стадій (близько 70), на сьогоднішній час він  не використовується.

 

2.1.3. Природні джерела  отримання вітаміну

Джерела рослинні: морська капуста, соя і соєві продукти, хміль, шпинат, зерна пророслої пшениці, зелена цибуля, салати, бадилля редиски, моркви, ріпи, пивні та пекарські дріжджі.

Джерела тваринні: свиняча або теляча печінка (у поєднанні з овочами, при цьому овочей необхідно вживати в три рази більше, ніж паштету або печінки), нирки, яловичина, домашня птиця, риба, молоко, сир, морепродукти (креветки, кальмари, устриці, оселедець, макрель), ліверний паштет, сирий яєчний жовток, кисломолочні продукти.

 

2.2. Вплив основних факторів і параметрів на процес біосинтезу

До основних параметрів, що впливають на процес біосинтезу потрібно віднести :

• параметри культивування  (температура, тиск, частота перемішування, час культивування);

При зміні часу культивування ми не отримуємо потрібну для даного препарату кількість колонієутворювальних одиниць (КУО). Якщо  буде змінена температура вирощування то дані умови будуть не оптимальними для росту культури коферменту, що також призведе до зниження КУО. Збільшення тиску та частоти перемішування також вплине на кількість КУО, оскільки підвищення даних параметрів відіб’ється на життєздатності клітин.

Зменшення частоти  або часу центрифугування призведе до потрапляння культуральної рідини до готової продукції, збільшення ж даних параметрів призведе до зменшення кількості клітин.

Завданням цього проекту є: підбір оптимальної технологічної схеми; вибір найкращого продуцента; розрахунок складу поживного середовища для виробництва вітаміну - ціанкобаламіну.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ТЕХНОЛОГІЧНА  ЧАСТИНА РОБОТИ

Розділ 3. Характеристика кінцевого продукту виробництва вітаміну - ціанкобаламіну

Вітамін В₁₂, або ціанкобаламін, - важливе біологічне з'єднання, активний гематопоетичний фактор ссавців і ростовий фактор для багатьох видів мікроорганізмів і тварин. 
      Структура вітаміну B₁₂ було вперше визначено в 1956 році Дороті Ходжкін методом дифракції рентгенівських променів.Це була найбільша органічна молекула, структури якої вдалося визначити методами рентгено-структурного аналізу. Циклічна система вітаміну B₁₂ подібна циклічної системі порфіринів (рис. 3.1.); вона складається з чотирьох пірольних кілець з атомом кобальту в центрі. 
      Опис продукту

 Вітамін  B 12 кристалізується у вигляді  темно-червоних голок або призм; колір варіює залежно від величини кристалів. Кристали темніють при 210-220 °, але не плавляться при температурі нижче 300◦С. Першими встановленими константами були показники заломлення, а саме α = 1,616, β = 1,652, γ = 1,664. Кристалографічні виміри показують, що кристали відносяться до орторомбічної системі і мають призматичну форму. При кристалізації з водного розчину і з суміші води з ацетоном вони містять значну, але мінливе кількість неміцно пов'язаної кристалізаційної води.Її можна видалити нагріванням при зниженому тиску, причому кристали не втрачають своєї форми. Після цього зневоднений матеріал може знову поглинати вологу з атмосферного повітря в кількості 10-12%, це і є той продукт, який зазвичай випускається під назвою вітаміну B₁₂ і зареєстрований в фармакопеях Англії і США. Вітамін B₁₂ досить добре розчинний у воді (близько 1,2% при кімнатній температурі), а також у нижчих спиртах, в нижчих аліфатичних кислотах і в фенолах, але розчиняється в багатьох інших органічних рідинах. Він практично не розчиняється в піридині та інших теоретичних аминах, але розчинний в деяких рідких або розплавлених амідів, наприклад в ацетамід і диметилформаміді. Вітамін B₁₂ має діамагнітні властивості, що вказує на тривалентний стан кобальту. Зазвичай вітамін виділяють з мікробної маси або тваринних тканин, використовуючи розчини, які містять ціанід-іони, що грають роль шостого ліганда кобальту. Однак сам ціанкобаламін метаболічно не активний. До складу ферментів входить з'єднання, в якому ціаногруппа заміщена залишком 5-дезоксиаденозину або метильних радикалів.

Молекулярна структура

Вітамін B₁₂ - перша органометалева сполука, виділена з біологічної системи. З неполімерних органічних сполук має найбільш складну будову, зображене на рисунку. Молекула складається з двох майже планарних циклічних структур і лінійної дільниці. Метал 3 + 3 пов'язаний з макроциклом, сильно нагадує порфиринове ядро ​​гема. Це тетрапірольна структура, але має ту особливість, що замість метанових містків, що зв'язують 4 пірольних кільця, кільця А і D безпосередньо пов'язані. Друга кільцева структура - азотистих основ - 5,6-диметилбензимідазол (5,6 ДМБ). 5,6 ДМБ з'єднаний з першої кільцевої системою гетерогенної бічним ланцюгом, що складається з N – аміно – 2 -пропанолу (ізопропанола), етерифікованих фосфатом 3 - мононуклеотид, пов'язаного з основою 5,6 ДМБ Na - Глікозидний зв'язком. 

 

 

Рис 3.1. Структура ціанкобаламіну  

В даний час в промисловості для вироблення вітаміну використовують в основному три штами бактерій: Pseudomonas denitrificans, представників роду Propioniоbacterium і метаногенних бактерії (змішану культуру). У всіх випадках незалежно від використовуваного штаму і умов культивування в середовище вводять іони кобальту і часто 5,6 ДМБ. . Додавання таких попередників корріноідів, як гліцин, треонін, 6-АЛК і амінопропанол, може надавати стимулюючу дію на вітаміноутворення.

Інструкція  для медичного застосування препарату

Ціанкобаламін ( ВІТАМІН В12) (CYANOCOBALAMIN (VITAMIN B12))

Загальна  характеристика:

міжнародна та хімічна   назви:  cyanocobalamin, a-(5,6-диметилбензимідазол-1-іл)-кобаміду ціанід;

основні фізико-хімічні  властивості: прозора, яскраво-червоного  кольору рідина;

склад: 1 мл розчину  містить ціанокобаламіну   0,5 мг (500 мкг);

допоміжні речовини: натрію хлорид, вода для ін'єкцій.

Форма випуску: Розчин для ін'єкцій.

Фармакотерапевтична группа: Вітамін В₁₂ (ціанокобаламін та його аналоги)

Код АТС В 03В  А 01.

 

Фармакологічні  властивості: Фармакодинаміка. Ціанокобаламін активує обмін вуглеводів, білків та ліпідів, бере участь у синтезі лабільних метильних груп, в утворенні холіну, метіоніну, нуклеїнових кислот, креатину, сприяє накопиченню в еритроцитах сполук із сульфгідрильними групами. Як фактор росту стимулює функцію кісткового мозку, що необхідно для нормобластичного еритропоезу. Препарат сприяє нормалізації порушених функцій печінки та нервової системи, активує систему згортання крові, спричиняє (високі дози) підвищення тромбопластичної активності та активності протромбіну.

В організмі  людини та тварин синтезується мікрофлорою кишечнику, але цим синтезом потреба у вітаміні не забезпечується і додаткову кількість його організм одержує з продуктами харчування.

Фармакокінетика: Метаболізується в тканинах, перетворюючись у кофермент ну форму - аденозилкобаламін, який є активною формою ціанокобаламіну. Виводиться з жовчю і сечею.

Показання для застосування: Злоякісні, постгеморагічні та залізо дефіцитні анемії; а пластичні анемії у дітей, анемії аліментарного характеру; анемії спричинені токсичними речовинами і лікарськими засобами, анемії, пов'язані з дефіцитом вітаміну В12, незалежно від причин дефіциту (резекція шлунка, глистні інвазії, порушення процесу всмоктування з кишечнику, вагітність). Полі неврити, невралгії трійчастого нерва, радикуліт, каузалгії, діабетичні неврити, аміотрофічний боковий склероз. Спру (разом із кислотою фолієвою), захворювання печінки (гепатити, цирози), променева хвороба.

Спосіб застосування та дози. Ціанокобаламін вводять внутрішньом'язово, підшкірно

або внутрішньо венно, а при   боковому аміотрофічному склерозі також інтралюмбально.

Лікування дорослих:

При анеміях  спричинених токсичними речовинами і лікарськими засобами, анеміях, пов'язаних з дефіцитом вітаміну В12, незалежно від причин дефіциту (резекція шлунка, глистні інвазії, порушення процесу всмоктування з кишечнику, вагітність) призначають у дозах 100-200 мкг (0,1-0,2 мг) через день до досягнення ремісії.

При злоякісному  малокрів’ї з   симптоми   фунікулярного   мієлоза   і   при   макроцитарних   анеміях з ушкодженням нервової системи ціанокобаламін застосовують дорослим у разовій (добовій) дозі 400-500 мкг (0,4- 0,5 мг). В перший тиждень вводять щоденно, а потім з інтервалами між введенням у 5-7 днів (одночасно призначають фолієву кислоту). У тяжких випадках вводять у спинномозковий канал, починаючи з разової дози дорослим 15-30 мкг (для таких доз використовують Ціанокобаламін інших концентрацій), і при кожній наступній ін'єкції дозу збільшують (50,100, 150, 200 мкг). Інтралюмбальні ін'єкції роблять кожні 3 дні, всього на курс необхідно 8-10 ін'єкцій. У період ремісії при відсутності явищ фунікулярного мієлозу для підтримуючої терапії призначають по 100 мкг двічі на місяць, при наявності неврологічних симптомів – дорослим по 200-400 мкг (0,2-0,4 мг) 2-4 рази протягом місяця.

При   боковому   аміотрофічному     склерозі,     поліневриті, невралгії трійчатого нерва, радикуліті, каузалгії   препарат   вводять   у зростаючих дозах  дорослим від 200 до 500 мкг (від 0,2 до 0,5 мг) на ін'єкцію на добу, а при покращанні стану - 100 мкг на добу. Курс лікування – до 2 тижнів.