Влияние кинетики процесса, протекающего в системе Fе(III) – органический реагент-восстановитель органической природы на величину антиокси

Антиоксиданты прямого действия, наоборот, обладают непосредственными антирадикальными свойствами, которые можно обнаружить в тестах in vitro. Б. Холлиуэлл и Дж. Гатридж определяют такие АО, как «любую субстанцию, которая, присутствуя [в среде] в низкой концентрации, сравнимой с концентрацией способного окисляться субстрата, достоверно снижает или предотвращает окисление этого субстрата». Большую часть широко используемых лекарственных препаратов антиоксидантного действия составляют АО прямого действия. Им же уделяется основное внимание при поиске новых АО, имеющих перспективы клинического или коммерческого применения. Это связано с тем, что первичный скрининг таких АО можно эффективно проводить с использованием относительно простых тест-систем in vitro. Эффективность АО прямого действия меньше зависит от функционального состояния метаболических систем организма [12].

Удобным способом классификации  представляется совмещение перечисленных классификаций, т.е. подразделение АО по наличию в структуре молекулы определенных функциональных групп,  связанных с проявлением антиоксидантных свойств. В этом случае наиболее наглядна взаимосвязь между химической структурой и свойствами АО, т.е. зависимость между наличием определенных функциональных групп и механизмом действия. АО прямого действия можно разделить на пять основных категорий: доноры протона; полиены; катализаторы, ловушки радикалов; комплексообразователи [12]. Среди АО прямого действия можно также выделить соединения фенольного типа (полифенолы). К наиболее важным антиоксидантам относятся:

Действие полифенолов  связано с их эффективным взаимодействием  их с пероксидными радикалами. С этим связано применение антиоксидантов для увеличения сроков хранения различных лекарственных форм. Биологическая активность некоторых полифенольных АО обусловлена стереоэлектронными эффектами ароматического и хроманового колец, орто- и пара-положением гидроксильных групп, их mpem-бутильным экранированием, образованием семихинонных форм, тиолсодержащими соединениями, хелатированием металлов переменной валентности, рецепторным взаимодействием с клеточной мембраной и т.д. [8]

1.3 Определение антиоксидантной активности индивидуальных веществ, растительного сырья и пищевых продуктов

Интерес к изучению антиоксидантных  свойств пищевых продуктов, являющихся источником природных антиоксидантов, сопровождается разработкой новых, эффективных методов определения антиоксидантной активности (АОА). В настоящие время известно достаточно большое количество методов оценки антиоксидантной способности индивидуальных соединений и суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов. Наиболее популярными являются методы, основанные на способности антиоксидантов ингибировать окисление жиров, связывать свободные радикалы, восстанавливать ионы металлов переменной валентности.

1.4 Спектрофотометрические методы определения антиоксидантной активности

Обычно выделяют две  группы методик спектрофотометрического  определения АОА реальных объектов:  а) методики, связанные с применением  реагентов радикального характера;  б) методики, основанные на окислительно-восстановительных реакциях, например на восстановлении антиоксидантами Fe(III) до Fe(II).

1. Методы определения антиоксидантной активности с применением реагентов радикального характера

Наиболее известным  способом оценки АОА [108] является методика, основанная на взаимодействии реагента DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (C18H12N5O6, M = 394,33), растворенного в метаноле, с антиоксидантами (АН) по схеме:

DPPH* + AH → DPPH-H + A*.

В результате восстановления DPPH антиоксидантом снижается пурпурно-синяя  окраска DPPH в метаноле, а реакция  контролируется по изменению оптической плотности при 514 нм обычными спектрофотометрическими методами. Примером может быть работа [13]. Авторы исследовали антиоксидантную активность и фенольный состав экстрактов Rhus coriaria L. Экстракция проводилась метанолом, в результате чего были получены две фракции – водная и этилацетатная. Органическая фаза затем была подвергнута разделению на Sephadex LH-20. АОА экстракта и фракций была определена при помощи тиоционата  железа и DPPH-радикальным методом. Фенольный состав активных фракциий был определен методом HPLC-MS. Те фракции, которые показали наибольшую АОА, были богаты антоцианами и гидролизованными танинами.

Другой известный спектрофотометрический метод определения АОА основан  на применении в качестве радикал-реагента 2,2′-азино-бис(3-этилбензтиазолино-6-сульфоновой кислоты (ABTS). Рабочий раствор, содержащий 2,0 мМ ABTS и 0,86 нМ пероксидазы хрена в 50 мМ фосфатном буфере (рН=7,0), загружается в количестве 240 мкл в ячейки 96-луночной планшеты. Туда же добавляется 10 мкл образца и 25 мкл 1 мМ раствора перекиси водорода в 50 мМ фосфатном буфере. Отсчет времени до начала образования зеленой окраски радикала ABTS+ начинался немедленно. Система калибровалась по аскорбиновой кислоте, выстраиванием зависимостей времени индукции (до появления зеленой окраски) от концентрации аскорбиновой кислоты. АОА образцов выражали в количестве 1 мг аскорбиновой кислоты на г исследованного растения.

2. Методы, основанные на использовании комплексов переходных металлов и определении суммы восстановителей

Для большинства биологически важных антиоксидантов (флавоноидов, фенолкарбоновых  кислот, токоферолов, аскорбиновой кислоты) характерна высокая восстановительная  активность, в том числе, по отношению  к ионам металлов переменной валентности, например, Fe⁺³, Cu⁺², Ru⁺⁴. На этом свойстве основано несколько способов определения антиоксидантов в различных объектах [14 – 17]. Для определения антиоксидантной активности индивидуальных соединений и пищевых продуктов обычно используют две системы, содержащие Fe⁺³: феррицианид К₃Fe(CN)₆ [18] и Fe⁺³ – TPTZ (трипиридилтриазин) [19 - 21].

Наиболее известны методики определения  АОА, основанные на восстановлении антиоксидантами (например, аскорбиновой кислотой) соединений железа (III) и фотометрировании комплексов Fe(II) с разными реагентами лигандного характера (пиридил -2,6-дикарбоновая кислота, ферроцин, трипиридилтриазин, o-фенантролин, дипиридил и др.). Этот способ определения АОА в англоязычной литературе называют методом FRAP (ferric reducing/antioxidant power) [22]. Он позволяет определять низкомолекулярные антиоксиданты, обладающие восстановительными свойствами. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивной голубой окраски. Метод отличается простотой, быстротой и небольшими затратами при исполнении.

При взаимодействии антиоксидантов или объектов, обладающих антиоксидантными свойствами с феррицианидом [К₃Fe(CN)₆] происходит его восстановление до ферроцианида [К₄Fe(CN)₆]. Реакцию проводят при температуре 50 ºС в течение 20 – 30 мин. Содержание ферроцианида в реакционной системе определяют спектрофотометрическим способом по реакции с FeCI₃, в результате которой образуется окрашенный комплекс ферроцин (берлинская лазурь), абсорбирующий в видимой области спектра (λ_max = 700 нм):

К₃Fe⁺³(CN)₆ + ē ® К₄Fe⁺²(CN)₆

К₄Fe⁺²(CN)₆ + FeCI₃ ® КFe⁺³[Fe⁺²(CN)₆].

Оптическая плотность  раствора пропорциональна антиоксидантной  активности исследуемого объекта, которую  обычно выражают в эквивалентах аскорбиновой кислоты. Метод используется для оценки антиоксидантной активности индивидуальных веществ и пищевых продуктов: антрохинонов, аскорбиновой и галловой кислот [23], листовых овощей , специй.

При восстановлении Fe⁺³, связанного в бесцветный комплекс с трипиридилтриазином (Fe⁺³ – TPTZ) образуется окрашенное соединение (Fe⁺² – TPTZ) с максимумом поглощения при 593 нм. Величина оптической плотности зависит от антиоксидантной активности исследуемого объекта, которую выражают в мМ Fe⁺²/дм³ [24], а также относительно активности вещества-стандарта: тролокса или аскорбиновой кислоты. Метод используется для определения антиоксидантной активности пищевых продуктов: черного и зеленого чая [25], фруктов, вина [19, 20], меда [21], кофе, и лекарственных растений.

Теоретически  обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин и  вещества стандарта – аскорбиновой кислоты для определения АОА [26]. В ходе исследований было изучено влияние ряда индивидуальных восстановителей (галловой кислоты, кверцетина, рутина, аскорбиновой кислоты) на индикаторную систему и установлено, что аналитический сигнал линейно зависит от их концентраций в широком диапазоне. На этой основе разработана методика определения антиоксидантной активности красных сухих вин. Так как разбавление анализируемого образца может привести к изменению его вещественного состава, в частности за счет протекания гидролиза, для проведения анализа необходимо оптимизировать условия: разбавлять в постоянном соотношении 1:200, а через 60 минут добавлять «стоп-реагент».

Авторами работы [27] была теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования индикаторных окислительно-восстановительных систем Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин и Fe(III)/Fe(II)−2,2^/-дипиридил для определения суммарной антиоксидантной активности ряда пищевых продуктов. Показано, что регистрируемый аналитический сигнал является результатом совместного действия всех присутствующих в исследуемом объекте восстановителей органической природы, а величина антиоксидантной активности – интегральной. Разработана методика определения суммарной антиокcидантной активности пищевых продуктов спектрофотометрическим методом. По предлагаемой методике с использованием изучаемых индикаторных систем определена антиоксидантная активность ряда пищевых продуктов и растительного сырья.

Для определения  АОА также применяют методики, связанные с применением в  качестве реагентов-окислителей соединений меди (II) и рутения (IV) и церия (IV).

Авторы [28] недавно разработали метод определения АОА на основе Ce (IV). Цель этой работы состоит в том, чтобы изменить существующее спектрофотометрическое определение основанное на восстановлении церия так, чтобы Ce (IV) выборочно окислял бы антиокидантные   составы, но не лимонную кислоту и восстановленные сахара. Окислительно-восстановительный потенциал Ce (IV) - окислитель был подобран в H₂SO₄ 0.3 M H₂SO₄ + 0.7 M Na₂SO₄ в водной среде так, чтобы выборочно окислить АО, но не лимонную кислоту, простой сахар, и другие фармацевтические компоненты. Последовательность АОА в эквивалентах тролокса (TEAC)  кверцетин>рутин> галловая кислота> катехин> кофейная кислота> феруловая кислота> naringenin> naringin> тролокс> аскорбиновая кислота была установлена на основе предложенного метода, и, как выяснилось, была сопоставима с результатами  найденными другими методами определения АО. Также примечательно, что была найдена полная АОА naringin и рутина гидролизованных в кислой среде, не измеренная ранее другими методами TAC. Модифицированный метод на основе Ce (IV) работал в присутствии лимонной кислоты и восстановленных сахаров, не изменяя определения полной АОА кверцетина. Одновременный гидролиз и окисление naringin – еще одно преимущество перед другими подобными методами определения. Предложенный метод определения TAC с Ce (IV) является простым, дешевым, быстрым, и может быть легко применим в скромно снабженных обычных лаборатория.

1.5 Кинетические методы

В действительности любой химический процесс, независимо от его природы, протекает с конечной скоростью и стремится к установлению равновесия, так что можно выделить две характерные области - кинетическую (динамическую) и равновесную (статическую); последняя реализуется, когда все протекающие в системе реакции достигли состояния равновесия. Обе области можно использовать для получения разнообразной аналитической информации. Скорость протекания химических реакций зависит от таких факторов, как температура, давление или концентрация реагентов, а также от присутствия катализаторов, активаторов или ингибиторов. Некоторые реакции (например, нейтрализация сильных кислот сильными основаниями) идут столь быстро, что равновесие достигается практически сразу, тогда как другие (независимо от их термодинамической выгодности) протекают настолько медленно, что изменения не удается заметить даже после того, как пройдет значительное время. Такова хорошо известная реакция между мышьяком(III) и церием(IV) при комнатной температуре [29].

Исследовать скорости реакций в зависимости от экспериментальных условий крайне важно, так как знание кинетических свойств системы позволяет химику изменять скорость в соответствии со своими потребностями. Тщательно подбирая условия, можно добиться того, что скорость реакции какого-либо компонента смеси будет заметно отличаться от скорости реакции других, т. е. обеспечить избирательность анализа. Самые медленные при обычных условиях реакции можно резко ускорить, устанавливая подходящую температуру или добавляя катализатор, способствующий снижению активационного барьера.

Кинетические  методы классифицируют по разным признакам. Вероятно, лучшая классификация опирается на деление на каталитические и некаталитические методы. В свою очередь, каталитические методы подразделяются на классы в зависимости от типа реакции; некаталитические классифицируют по назначению - для определения отдельных компонентов или нескольких сразу (дифференциальные кинетические методы).

Кинетические  методы, несмотря на некоторую сложность  проведения анализа в динамических условиях, имеют определенные преимущества перед равновесными. Они дают возможность использовать самые разнообразные химические реакции, непригодные для проведения определения в статическом режиме (например, медленные). В системах с медленно протекающими реакциями, по мере их приближения к завершению, может наблюдаться увеличение роли побочных процессов, но для кинетических методов это обычно не создает проблем. В кинетических методах можно использовать реакции протекающие не количественно и непригодные для равновесных вариантов. Кинетические методы характеризуются большими возможностями в случае анализа следов благодаря более высокой чувствительности (особенно если используют каталитические реакции). Кинетические методы позволяют раздельно определять близкородственные соединения за счет различия в скорости их взаимодействия с одним и тем же реагентом (дифференциальные методы).

В то же время  весьма серьезный недостаток кинетических методов состоит в необходимости  каждый раз при проведении анализа тщательно воспроизводить условия эксперимента. Воспроизведение условий реакции для кинетических методов всегда значит гораздо больше, чем для равновесных (поскольку время в них всегда является важнейшей переменной).

Возрастание роли кинетических методов можно связать с потребностью в определении ультрамалых (несколько нанограммов и меньше) содержаний при анализе высокочистых веществ, объектов окружающей среды и биологических образцов; развитием представлений о механизмах реакций и в особенности с огромными достижениями в приборостроении, в частности, автоматизации и компьютеризации.