Учитывая данные Тунберга и
Сент-Дьердьи и исходя из собственных
экспериментов по изучению взаимопревращения
различных органических кислот и их влияния
на дыхание летательной мышцы голубя,
английский биохимик Г. А. Кребс в 1937 г.
предложил схему последовательности окисления
ди- и трикарбоновых кислот до С02 через «цикл
лимонной кислоты» за счет отнятия водорода.
Этот цикл и был назван его именем.
Непосредственно в цикле окисляется
не сам пируват, а его производное - ацетил-СоА.
Таким образом, первым этапом на пути окислительного
расщепления ПВК является процесс образования
активного ацетила в ходе окислительного
декарбоксилирования. Окислительное декарбоксилирование
пирувата осуществляется при участии
пируватдегидрогеназного мультиферментного
комплекса. В состав его входят три фермента
и пять коферментов. Коферментами служат
тиаминпирофосфат (ТПФ) - фосфорилированное
производное витамина В6 липоевая
кислота, коэнзим A, ФАД и НАД+. Пируват
взаимодействует с ТПФ (декарбоксилазой),
при этом отщепляется С02 и образуется
гидроксиэтильное производное ТПФ. Последнее
вступает в реакцию с окисленной формой
липоевой кислоты. Дисульфидная связь
липоевой кислоты разрывается и происходит
окислительно-восстановительная реакция:
гидроксиэтильная группа, присоединенная
к одному атому серы, окисляется в ацетильную
(при этом возникает высокоэнергетическая
тиоэфирная связь), а другой атом серы
липоевой кислоты восстанавливается.
Образовавшаяся ацетиллипоевая кислота
взаимодействует с коэнзимом А, возникают
ацетил- СоА и восстановленная форма липоевой
кислоты. Водород липоевой кислоты переносится
затем на ФАД и далее на НАД + . В результате
окислительного декарбоксилирования
пирувата образуются ацетил-СоА, С02 и НАДH.
Дальнейшее окисление ацетил-СоА
осуществляется в ходе циклического процесса.
Цикл Кребса начинается с взаимодействия
ацетил-СоА с енольной формой щавелевоуксусной
кислоты. В этой реакции под действием
фермента цитратсинтазы образуется лимонная
кислота. Следующий этап цикла включает
две реакции и катализируется ферментом
аконитазой, или аконитатгидратазой (3).
В первой реакции в результате дегидратации
лимонной кислоты образуется цис-аконитовая.
Во второй реакции аконитат гидратируется
и синтезируется изолимонная кислота.
Изолимонная кислота под действием НАД-
или НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы
(4) окисляется в нестойкое соединение
- щавелевоянтарную кислоту, которая тут
же декарбоксилируется с образованием
б-кетоглутаровой кислоты (б-оксоглутаровой
кислоты).
б-Кетоглутарат, подобно пирувату,
подвергается реакции окислительного
декарбоксилирования. б-Кетоглутаратдегидрогеназный
мультиэнзимный комплекс (5) сходен с рассмотренным
выше пируватдегидрогеназным комплексом.
В ходе реакции окислительного декарбоксилирования
б-кетоглутарата выделяется С02, образуются
НАДH и сукцинил-СоА.
Рис. 5. Цикл Кребса
Подобно ацетил-СоА, сукцинил-СоА
является высокоэнергетическим тиоэфиром.
Однако если в случае с ацетил-СоА энергия
тиоэфирной связи расходуется на синтез
лимонной кислоты, энергия сукцинил-CoA
может трансформироватся в образование
фосфатной связи АТФ. При участии сукцинил-
СоА-синтетазы (6) из сукцинил-СоА, АДФ и
Н3Р04 образуются
янтарная кислота (сукцинат), АТФ, регенерирует
молекула СоА. АТФ образуется в результате
субстратного фосфорилирования.
На следующем этапе янтарная
кислота окисляется до фумаровой. Реакция
катализируется сукцинатдегидрогеназой
(7), коферментом которой является ФАД.
Фумаровая кислота под действием фумаразы
или фумаратгидратазы (8), присоединяя
Н20, превращается
в яблочную кислоту (малат). И, наконец,
на последнем этапе цикла яблочная кислота
с помощью НАД- зависимой малатдегидрогеназы
(9) окисляется в щавелевоуксусную. ЩУК,
которая самопроизвольно переходит в
енольную форму, реагирует с очередной
молекулой ацетил-СоА и цикл повторяется
снова.
Следует отметить, что большинство
реакций цикла обратимы, однако ход цикла
в целом практически необратим. Причина
этого в том, что в цикле есть две сильно
экзергонические реакции - цитратсинтазная
и сукцинил-СоА-синтетазная.
На протяжении одного оборота
цикла при окислении пирувата происходит
выделение трех молекул С02, включение
трех молекул Н2О и удаление
пяти пар атомов водорода. Роль Н2О в цикле Кребса
подтверждает правильность уравнения
Палладина, который постулировал, что
дыхание идет с участием Н2О, кислород
которой включается в окисляемый субстрат,
а водород с помощью «дыхательных пигментов»
(по современным представлениям - коферментов
дегидрогеназ) переносится на кислород
.
Большинство ферментов цикла
Кребса локализовано в мАТФиксе митохондрий,
аконитаза и сукцинатдегидрогеназа - во
внутренней мембране митохондрии.
Энергетический выход цикла
Кребса, его связь с азотным обменом. Цикл Кребса,
играет чрезвычайно важную роль в обмене
веществ растительного организма. Он служит
конечным этапом окисления не только углеводов,
но также белков, жиров и других соединений.
В ходе реакций цикла освобождается основное
количество энергии, содержащейся в окисляемом
субстрате, причем большая часть этой
энергии не теряется для организма, а утилизируется
при образовании высокоэнергетических
конечных фосфатных связей АТФ.
В ходе окисления пирувата имеют
место 5 дегидрирований, при этом получаются
3НАДH, НАДФH (в случае изоцитратдегидрогеназы)
и ФАДH2. Окисление каждой молекулы НАДH
(НАДФH) при участии компонентов электронтранспортной
цепи митохондрий дает по 3 молекулы АТФ,
а окисление ФАДH2 - 2АТФ. Таким образом
при полном окислении пирувата образуются
14 молекул АТФ. Кроме того, 1 молекула АТФ
синтезируется ; в цикле Кребса в ходе
субстратного фосфорилирования. Следовательно,
при окислении одной молекулы пирувата
может образоваться 15 молекул АТФ. А поскольку
в процессе гликолиза из молекулы глюкозы
возникают две молекулы пирувата, их окисление
даст 30 молекул АТФ.
Итак, при окислении глюкозы
в процессе дыхания при функционировании
гликолиза и цикла Кребса в общей сложности
образуются 38 молекул АТФ (8 АТФ связаны
с глико- лизом). Если принять, что энергия
третьей сложноэфирнои фосфатной связи
АТФ равняется 41,87 кДж/моль (10 ккал/моль),
то энергетический выход гликолитического
пути аэробного дыхания составляет 1591
кДж/моль (380 ккал/моль).
Значение цикла Кребса не ограничивается
его вкладом в энергетический обмен клетки.
Не менее важную роль играет то обстоятельство,
что многие промежуточные продукты цикла
используются при синтезе различных соединений.
Из кетокислот в ходе реакций переаминирования
образуются аминокислоты. Для синтеза
липидов, полиизопренов, углеводов и ряда
других соединений используется ацетил-СоА.
Регуляция цикла Кребса. Дальнейшее
использование образующегося из пирувата
ацетил-СоА зависит от энергетического
состояния клетки. При малой энергетической
потребности клетки дыхательным контролем
тормозится работа дыхательной цепи, а
следовательно, реакций ЦТК и образования
интермедиатов цикла, в том числе оксалоацетата,
вовлекающего ацетил-СоА в цикл Кребса.
Это приводит к большему использованию
ацетил-СоА в синтетических процессах,
которые также потребляют энергию.
Особенностью регуляции ЦТК
является зависимость всех четырех дегидрогеназ
цикла (изоцитратдегидрогеназы, б-кетоглутаратдегидрогеназы,
сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы)
от отношения [НАДH]/[НАД+]. Активность цитратсинтазы
тормозится высокой концентрацией АТФ
и собственным продуктом - цитратом. Изоцитратдегидрогеназа
ингибируется НАДH и активируется цитратом.
б-Кето- глутаратдегидрогеназа подавляется
продуктом реакции - сукцинил-СоА и активируется
аденилатами. Окисление сукцината сукцинатдегидрогеназой
тормозится оксалоацетатом и ускоряется
АТФ, АДФ и восстановленным убихиноном
(QH2). Наконец, малатдегидрогеназа ингибируется
оксалоацетатом и у ряда объектов - высоким
уровнем АТФ. Однако степень участия величины
энергетического заряда, или уровня адениновых
нуклеотидов, в регуляции активности цикла
Кребса у растений до конца не выяснена.
Регулирующую роль может играть
также альтернативный путь транспорта
электронов в растительных митохондриях.
В условиях высокого содержания АТФ, когда
активность основной дыхательной цепи
снижена, окисление субстратов через альтернативную
оксидазу (без образования АТФ) продолжается,
что поддерживает на низком уровне отношение
НАДH/НАД+ и снижает уровень АТФ. Все это
позволяет циклу Кребса функционировать.
Рис.5
ацетил-КоА
+ 3NAD+ + FAD + GDP = 2CO2 + 3NADH + H+ + FADH2 + GTP + HS-KoA
Задание 28.
Известно, что высокие концентрации
аммиака сдвигают рН в щелочную сторону.
Как это отразится на энергетическом состоянии
клетки?
Решение:
Концентрация аммиака в сыворотке
крови в норме 11—35 мкмоль/л. В крови и цитозоле
клеток при физиологических значениях
рН аммиак переходит в ион аммония — NH4+, количество
неионизированного NH3 невелико (~ 1%).
Аммиак — токсичное соединение.
Даже небольшое повышение его концентрации
оказывает неблагоприятное действие на
организм, и, прежде всего на ЦНС.
Повышение концентрации аммиака
в крови сдвигает рН в щелочную сторону,
вызывает алкалоз. Алкалоз увеличивает
сродство гемоглобина к кислороду, что
препятствует отдачи им кислорода. В результате
развивается гипоксия тканей, энергодефицит,
от которого главным образом страдает
головной мозг. Высокие концентрации аммиака,
при участии глутаминсинтетазы, стимулируют
синтез глутамина из глутамата в нервной
ткани:
Глу + NH3 + АТФ → Глн + АДФ + Н3РО4.
Накопление глн в клетках нейроглии приводит
к повышению в них осмотического давления,
набуханию астроцитов и в больших концентрациях
вызвает отёк мозга. Снижение концентрации
глу нарушает обмен АК и нейромедиаторов,
в частности синтез γ-аминомасляной кислоты
(ГАМК), основного тормозного медиатора.
При недостатке ГАМК и других медиаторов
нарушается проведение нервного импульса,
возникают судороги. Ион NH4+ практически
не проникает через цитоплазматические
и митохондриальные мембраны. Избыток
NH4+ в крови нарушает трансмембранный перенос
одновалентных катионов Na+ и К+, конкурируя
с ними за ионные каналы, что также влияет
на проведение нервных импульсов. Низкие
концентрации аммиака стимулируют дыхательный
центр, а высокие – угнетают.
Задание 34.
Выберите и составьте последовательность
событий, происходящих при аллостерическом
ингибировании фермента:
а) уменьшается скорость превращения
субстрата в активном центре;
б) изменяется конформация фермента
в) эффектор присоединяется
в активном центре;
г) изменяется конформация аллостерического
центра;
д) нарушается комплементарность
активного центра субстрату;
е) эффектор присоединяется
в аллостерическом центре;
ж) изменяется конформация активного
центра.
Решение:
е) эффектор присоединяется
в аллостерическом центре;
г) изменяется конформация аллостерического
центра;
б) изменяется конформация фермента
ж) изменяется конформация активного центра.
д) нарушается комплементарность
активного центра субстрату;
а) уменьшается скорость превращения
субстрата в активном центре;
Задание 37.
Перечислите известные вам
типы регуляции активности ферментов
и подберите к каждому типу соответствующую
схему на рисунке:
Где S- субстрат, Э- эффектор,
Р- донор фосфата, П-фрагмент полипептидной
цепи.
Решение:
Рисунку 1 соответствует аллостерическая
регуляция активности ферментов. Аллостеричесий
центр - это участок фермента, пространственно
не совпадающий с активным центром, к которому
присоединяются регуляторы. В результате
изменения конформация фермента, что приводит
к изменению конформации активного центра
и его особенности свяывать и катализировать
субстрат. Аллостерические регуляторы:
субстраты, продукты реакций, ионы, макроэрги,
циклические нуклеотиды, коферменты.
Рисунку 2 соответствует химическая
модификация ферментов. Некоторые белки
при формировании третичной структуры
подвергаются постсинтетической химической
модификации. Активность ряда ключевых
ферментов обмена углеводов, в частности
фосфорилазы, гликогенсинтазы, также контролируется
путем фосфорилирования и деосфорилирования,
осуществляемого специфическими ферментами
– притеинкиназой и протеинфосфотазой,
активность которых в свою очередь регулируется
гормонами. Уровень активности ключевых
ферментов обмена углеводов и соответственно
интенсивность и направленность самих
процессов обмена определяются соотношением
фосфорилированных и дефосфо-рилированных
форм этих ферментов.
Обычно различают обратимую
ковалентную и нековалентную химические
модификации ферментов, осуществляемые
через ОН- группы серина, реже – тирозина
или за счет нековалентных взаимодействий
с молекулой фермента. В первом случае
активным ферментом оказывается или фосфорилированная,
или дефосфорилированная форма. Химическая
постснтетическая модификация ферментов
включает, кроме того, процессы ограниченного
протеолиза, метилирования, гликозирования,
уридилирования, аденилирования,АДФ- рибозилирования,
обеспечивая тем самым микроскопический
тип регуляции активности ферментов и,
соответственно, физиологическую скорость
процессов обмена веществ.
Рисунку 3 соответствует ограниченный
протеолиз, который является частным случаем
химической модификации. Это процесс,
в ходе которого от фермента отщепляется
олиго- или полипептидная цепь при участии
воды. В результате меняется химическая
структура фермента, его конформация и
способность катализировать реакцию.
Ограниченный протеолиз приводит только
к активации фермента, он необратим. Он
имеет важное значение, так как: 1) с помощью
этого процесса переводятся в активную
форму пептидазы пищеварительного тракта
(пепсин, трипсин, хемотрипсин), 2) необходим
для активации ферментов каскада свертывания
крови, 3) для перевода в активны формы
некоторых белково-пептидных гормонов
(инсулин, глюкагон).