Полисахариды и методы установления их структуры

 

Гетерополисахариды

     Установление строения гетерополисахаридов имеет ряд трудностей, связанных с их сложным составом и строением. Для исключения ошибок в исследованиях необходимо тщательно подходить к вопросам выделения и очистки полисахаридов данного типа.

Все гетерополисахариды можно разделить на две группы:

1) неразветвленные гетерополисахариды с регулярной структурой, в их молекуле монотонно повторяется одна и та же комбинация моносахаридов;

2) гетерополисахариды с нерегулярным или регулярным разветвленным строением.

В отличие от полисахаридов  первой группы, гетерополисахариды второй группы очень сложны по набору и последовательности входящих в них моносахаридов. Полного представления об их строении еще не имеется.

Гетерополисахариды значительно различаются по составу входящих в них моносахаридов, это связано в значительной мере с происхождением гетерополисахаридов. Чаще всего в качестве мономеров в них встречаются глюкоза, галактоза, глюкуроновая и галактуроновая кислоты, глюкозамин и галактозамин.

 С точки зрения функционального назначения полисахариды делятся на:

структурные, резервные и  полисахариды с иными функциями. Важнейшими структурными полисахаридами являются:

- целлюлоза (растения),

-хитин (насекомые),

- хондроитинсульфаты (животные).

Главными резервными полисахаридами являются крахмал (амилопектин + амилоза) и гликоген. Полисахариды с иными  функциями – камеди, слизи

 

Также полисахариды можно  классифицировать:

по кислотности:

·          нейтральные;

·          кислые

по характеру  скелета:

·          линейные;

·          разветвленные

по происхождению:

·          фитополисахариды (крахмал, инулин, камеди, слизи, пектиновые вещества, клетчатка);

·          зоополисахариды (гликоген, хитин);

·          полисахариды микроорганизмов.

В зависимости  от функций полисахариды делятся  на:

·          каркасные (конструктивные) – клетчатка, хитин;

·          энергетические (резервные, запасные) – крахмал, гликоген, инулин, слизи, альгиновые кислоты;

 защитные – слизи,  камеди.

 

     Установление строения простейших их представителей гетерополисахаридов основано на тех же приемах, которые используются при установлении строения гомополисахаридов. В некоторых условиях можно провести гидролиз определенного типа связи в гетерополисахаридах, что приводит к образованию характеристических олигосахаридных фрагментов. Такие фрагменты получаются в частности, при гидролизе полисахаридов, состоящих из чередующихся остатков нейтральных сахаров и уроновых кислот.

Например, полный гидролиз полисахарида пневмококков III дает смесь глюкозы и глюкуроновой кислоты в соотношении 1 : 1. При частичном гидролизе образуется дисахарид целлобиуроновая кислота, причем она является единственным продуктом реакции. Этот факт указывает на то, что полисахарид состоит из регулярно повторяемой единицы глюкоза – глюкуроновая кислота. Дальнейшая задача состоит в том, чтобы установить характер связей в повторяющейся цепи: глюкоза – глюкуроновая кислота – глюкоза – глюкуроновая кислота – и т. д.

С этой целью целлобиуроновую кислоту подвергают метилированию. При гидролизе полученного метильного производного образуется 2,3,4,6-O-тетрамегилглюкоза и 2,4-O-диметилглюкуроновая кислота. Это указывает на то, что в полимерной цепи остаток глюкозы связан с остатком глюкуроновой кислоты в третьем положении. Кроме того, ферментативным гидролизом показано, что глюкозидная связь имеет реконфигурацию.

 

 

 Для выяснения характера связи остатка глюкуроновой кислоты со следующим за ним в полимерной цепи остатком глюкозы полисахарид метилировался. Полученное метильное производное подвергалось каталитическому гидрированию, в результате которого происходило восстановление только карбометоксильной группы. Восстановленный продукт при гидролизе дает 2,3,6-O-триметилглюкозу и 2,4-O-диметилглюкозу. Последняя образовалась из остатка глюкуроновой кислоты при его восстановлении, что подтверждает связь 1→3 в структурной единице глюкоза — глюкуроновая кислота.

Другой компонент – 2,3,6-O-триметилглюкоза (соответствующий остатку глюкозы в полимерной цепи) свидетельствует о том, что в остатке глюкозы гидроксильная группа у C(4)-атома была закрыта. Следовательно, связь в последовательности глюкуроновая кислота – глюкоза строилась по типу 1→4. Таким образом, общая структура полимерной цепи в полисахариде пневмококков III соответствует предполагаемой на схеме:

 

 

     Аналогичным путем устанавливалось строение других неразветвленных гетерополисахаридов с регулярным строением полимерной цепи.

 

     Углеводные цепи, построенные по принципу олигосахаридов, можно продолжать почти до бесконечности. Так создаются высокомолекулярные структуры - полисахариды.

    Понятие повторяющегося звена, даже для таких простейших структур, как целлюлоза, амилоза, гиалуроновая кислота или агароза, не так примитивно, как может показаться на первый взгляд. Можно, конечно, отнестись к нему просто как к удобной форме сжатой записи, отражающей основные черты ковалентной структуры цепи.

          Для целлюлозы и амилозы хорошо известна характерная конформация цепей, т.е. то, как макромолекула организована в пространстве. Для целлюлозы это прямой стержень, в котором каждое следующее звено повернуто на 180 по отношению к предыдущему.

С амилозой дело обстоит сложнее. Ее молекула - спираль, на одном витке  которой помещается точно шесть  остатков глюкозы. Как любая правильная спираль, эта система повторяет  сама себя, если ее сдвинуть вдоль оси  на длину одного витка. В этом смысле повторяющееся звено амилозы  представляет собой отрезок цепи из шести моносахаридных остатков, т.е. остаток гексасахарида мальтогексаозы.

     Применительно к гиалуроновой кислоте и агарозе дисахаридные фрагменты также не отражают строения конформационных повторяющихся звеньев этих полисахаридов

     Многие полисахариды синтезируются клеткой по такой схеме: сначала происходит синтез олигосахарида, а затем его поликонденсация, сшивание в длинные цепи. Такой олигосахарид в биологическом смысле, т.е. с точки зрения путей биосинтеза этого полисахарида, и является истинным мономером полисахаридной цепи. Поэтому такой фрагмент называют «биологическим» повторяющимся звеном. И оно совсем необязательно совпадает с химическим повторяющимся звеном.

     Можно, наконец, рассмотреть и еще один - также биологический - аспект понятия о повторяющемся звене, связанный с взаимодействием готовой полисахаридной цепи с другими макромолекулами в живых системах. Речь в данном случае идет о том, каков минимальный фрагмент цепи, воспринимаемый другими молекулами или системами (назовем их рецепторами) как характерный признак данного полисахарида. Сюда относится широкий круг феноменов, таких, как иммунные реакции организма, сортировка макромолекул в клетке и в организме, преодоление клеточных барьеров, метаболизм полисахаридов и т.д.

     Рассмотрим лишь один наиболее простой пример: ферментативный гидролиз полисахаридов. Распространенный фермент животных организмов (лизоцим) специфически расщепляет гликозидные связи 14-связанных остатков N-ацетил-D-глюкозамина в полисахаридных цепях. В частности, он легко катализирует гидролиз полисахаридных цепей хитина:

     Для того, чтобы фермент мог нормально работать, его рецептору нужно одновременно «чувствовать» участок цепи из шести остатков глюкозамина: тогда он способен выполнять свою функцию - расщеплять четвертую гликозидную связь в этой последовательности. Если же регулярная цепь содержит меньше, чем шесть остатков, или они связаны иначе, чем в хитине, фермент не работает. Таким образом, «с точки зрения лизоцима», повторяющееся звено в хитине - гексасахаридный фрагмент.

     Полисахариды, о которых мы говорили выше, относятся к числу простейших полисахаридных структур[10]. Даже неразветвленные полисахариды, построенные из остатков моносахарида одного типа, могут иметь гораздо более сложное строение. Так, например, глюкан овса содержит сопоставимые количества остатков D-глюкопиранозы, связанных 13- и 14-связями. При этом, в отличие, например, от агарозы или гиалуроновой кислоты, эти связи не чередуются правильным образом и не образуют сколько-нибудь значительных блоков из однотипных связей. Поэтому чередование двух типов связей в полисахаридной цепи приходится в данном случае характеризовать как хаотическое. Этим утверждением можно было бы и ограничиться. Мы, однако, пока не знаем, является ли хаотичность истинной или кажущейся. В самом деле, здесь может быть (хотя отнюдь не обязательно должна быть) упорядоченность высшего порядка, которая не определена в данных (относительно грубых) методов исследования. Это можно пояснить, прибегнув к такой аналогии.

     Таким образом, видны два принципа построения полисахаридных цепей: правильное чередование (регулярность) и хаотическое расположение фрагментов (снова подчеркнем: хаотическое с точки зрения сегодняшних знаний). Возможен, кроме того, и блочный принцип. Так, например, устроена альгиновая кислота - полисахарид бурых водорослей (кстати, имеющий большое практическое значение как гелеобразователь). В ее линейную цепь входят остатки D-маннуроновой кислоты (38) и L-гулуроновой кислоты, соединенные 14-связями.

     Структурный анализ этого полисахарида показывает, что в его цепи имеются участки трех типов: более или менее длинные последовательности из мономеров одного типа, аналогичные последовательности мономеров второго типа, и участки, где остатки маннуроновой и гулуроновой кислот чередуются более или менее хаотически.

Сравнительно недавно было установлено, что некоторые полисахаридные цепи могут быть одновременно и нерегулярными, и регулярными, не нарушая при этом незыблемый принцип логики - закон исключительного третьего.

Например один из полисахаридов красных водорослей - порфиран. Он построен из чередующихся остатков D- и L-галактопиранозы (и в этом смысле подобен агарозе). Однако часть остатков D-галактозы превращена в метиловый эфир (по положению 6), а остатки L-галактозы входят в полисахарид частично в виде эфиров серной кислоты по положению 6, а частично в виде 3,6-ангидропроизводного, как в агарозе. Вариации каждого типа остатков распределены вдоль цепи хаотически, поэтому в целом цепь весьма нерегулярна. Однако, если порфиран обработать щелочью, то в остатках галактозы, этерифицированных серной кислотой, происходит замыкание 3,6-ангидроциклов. В результате все остатки L-галактозы становятся одинаковыми: нерегулярность по этим остаткам исчезает.

     Дальше можно все гидроксильные группы полисахарида превратить в метиловые эфиры (это делается при помощи метилирования - весьма важной в химии полисахаридов реакции, к рассмотрению которой мы еще вернемся). При этом унифицируется структура всех остатков D-галактозы. Получается производное полисахарида, содержащее совершенно правильное чередование метилированных остатков D-галактопиранозы и 3,6-ангидро-L-галактопиранозы (полисахарид становится регулярным).

Такая «регулярность-нерегулярность»  была обнаружена английским ученым Рисом  и названа им «замаскированной регулярностью» или «замаскированной повторяющейся  структурой». В последнее время  накапливается ряд данных, указывающих  на то, что такая замаскированная  регулярность - довольно распространенный принцип построения многих линейных полисахаридных цепей. Суть этого принципа не сводится только к тому, что нерегулярности могут быть (фактически или только в принципе) устранены с помощью  той или иной обработки. Дело здесь  значительно глубже. Можно полагать, что многие типы полисахаридов имеют  достаточно регулярный скелет цепи, в  которой некоторые звенья варьируют  по типу или (и) конфигурации отдельных  заместителей, что сравнительно мало отражается на геометрии макромолекулы  в целом. А иногда, наоборот, такие  вариации вносят в регулярную структуру  определенные, биологически осмысленные  нарушения, вызывающие, например, изломы в правильных спиралях. Подробнее об этом мы расскажем ниже.

     Были рассмотрены линейные полисахариды и был сделан вывод, что даже для простейших биополимеров этого класса, построенных из остатков одного-двух моносахаридов, возможны весьма значительные вариации типов структур, не говоря уже о бесчисленных вариациях конкретных структур внутри каждого типа. Системы, однако, резко усложняются, а возможности вариаций практически безгранично возрастают, если мы еще учтем существование разветвлений. Геометрия разветвленных полисахаридов может быть схематически типизирована следующим образом.

     Простейшие разветвленные системы содержат одну длинную линейную цепь, к которой присоединены разветвления в виде одиночных моносахаридных остатков или в крайнем случае в виде коротких олигосахаридов. Так устроен, например, ксилан, выделенный из березы. К регулярной цепи из 14-связанных остатков D-ксилопиранозы присоединены единичные остатки 4-О-метил-D-глюкуроновой кислоты, в среднем один на каждые десять ксилозных звеньев. Такие системы иногда называют «гребнеобразными полисахаридами».

           1.3. Медико - биологические свойства полисахаридов

     Медико-биологическое значение полисахаридов разнообразно[7]. Многие из них (крахмал, гликоген, инулин и др.) являются в растительных и животных организмах запасными питательными веществами. Некоторые полисахариды (например, хондроитинсерная кислота, капсулярные полисахариды и клетчатка) несут исключительно опорные и защитные функции.

     Ряд полисахаридов (маннапы, галактаны и др.) используется и как строительный, и как питательный материал. Гиалуроновая кислота, составляющая межклеточное вещество тканей животных, наряду со струхтурной функцией регулирует распределение жизненно необходимых веществ в тканях. Гепарин предотвращает свертывание крови в организме человека и животных. Во многих случаях полисахариды дают очень прочные комплексы с белками, образуя гликопротеины, выполняющие в организме ряд ответственных функций [8].

     В последнее время интерес к растительным полисахаридам возрос в связи с тем, что эти соединения, ранее считавшиеся инертными, обладают широким спектром фармакологической активности [9].

     Используются лекарственные растения, содержащие полисахариды в качестве отхаркивающих, обволакивающих, потогонных, слабительных средств [10]. Из полисахаридов получают лекарственные средства, применяемые как ранозаживляющие, противовоспалительные Подтверждена возможность использования полисахаридов в качестве кровезамещающих растворов [12].

Пектины винограда, смородины и  черники обладают значительной антифибринолитической активностью. Выраженный гемостатический эффект дают также альгинаты [13].