Характеристика физико-химических методов анализа, используемых для стандартизации маточного молочка

Хранение. Хранить прополис рекомендуется в сухих, чистых ящиках или ларях в хорошо проветриваемых, затемненных помещениях при температуре не выше 25°С. Срок хранения 5 – 7 лет.[2],[9]

1.5. Маточное молочко.(Las Apis)

Маточное молочко —  это секрет аллотрофических (глоточных  и верхнечелюстных) желез рабочих  пчел, активно функционирующих у  пчел-кормилиц в возрасте от 4—6 до 12—15 дней.

Химический  состав. В маточном молочке содержатся белковые вещества. Они включают гликопептиды и 9 ферментов (инвертаза, амилаза, глюкозооксидаза, холинэстераза и др.). Липиды маточного молочка состоят из нейтральных жиров, по меньшей мере четырех фосфолипидов (сфингомиелин, фосфатидилэтаноламин и др.), пяти гликолипидов (ганглиозиды) и девяти стеролов (холестерол, β-ситостерол, стигмастерол, 24-метиленхолестерол и др.). Из углеводов в состав маточного молочка входят главным образом глюкоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; из органических кислот — 21 аминокислота (аланин, аргинин, валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, таурин, тирозин, треонин, фенилаланин и др.), 2 нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) и 20 карбоновых и оксикарбоновых кислот, в том числе ненасыщенных. Последние на 70—90% состоят из 10-окси-транс-Δ2-деценовой кислоты, а в остальном из 9-окси-Δ2-деценовой, 10-оксидекановой, 2-децендикарбоновой, себациновой, n-оксибензойной, янтарной и др. Характерными соединениями маточного молочка являются два птерина — биоптерин и неоптерин. Прочие компоненты представлены ацетилхолином, аденозином, аденозинтрифосфатом и др. Найдено в маточном молочке 9 витаминов комплекса В. Минеральные вещества молочка включают неорганический фосфат, а также 15 катионов (калий, натрий, кальций, магний, железо, марганец, медь, никель, кобальт, кремний, хром, золото, ртуть, висмут, мышьяк). Всего в составе маточного молочка выявлено 110 соединений и зольных элементов. Состав маточного молочка изменяется в зависимости от возраста личинки, а также от внешних воздействий. Воды в нативном маточном молочке от 60 до 70% (в среднем 66%). Встречаются в нем и загрязняющие примеси — растительные волокна, пылевые частицы, нити мицелия, кусочки шкурок личинок, воска, прополиса, пыльца.[6]

Физические - химические свойства. Свежее маточное молочко — непрозрачная или полупрозрачная масса пастообразной консистенции белого, желтоватого или светло-кремового цвета, со специфическим запахом, кислая и острая (жгучая) на вкус. В воде оно растворяется не полностью, давая опалесцирующую суспензию, а в щелочной среде полностью, при этом часть механических примесей всплывает, а часть — оседает. Водный раствор маточного молочка, осветленный отстаиванием или центрифугированием, обнаруживает яркую светло-голубую флуоресценцию при возбуждении светом с длиной волны 366 нм. При 18—22° С подкисленный водный раствор маточного молочка (2 мг сухого вещества) восстанавливает 0,1 н перманганат калия примерно за 10 с. При 19—21° С рН нативного маточного молочка равно 3,0, а рН 1 %-ного водного раствора — 3,6—3,8. При содержании 33±2% сухих веществ и 20±1° С удельная электропроводность водного раствора маточного молочка равна (244±8)•10-6 сим (5%-ный раствор); поверхностное натяжение — 51±2 (1%-ный) и 66,5±1,0 (0,1%-ный раствор) дин/см2; вязкость — (10,0±0,3)•10-3 пуаз (0,25%-ный раствор). Плотность маточного молочка 1,1 г/см3, плотность его сухих веществ 1,40±0,05 г/см3. Маточное молочко улучшает общий обмен веществ, стимулирует центральную и периферическую нервную систему, гемопоэз, регулирует обмен липоидов и холестерина, возбуждает ретикуло-эндотелиальную систему и систему гипофиз — надпочечники. Оно подавляет развитие опухолей при 6-минутной обработке их клеток до инокуляции.

Маточное молочко, его  экстракты и растворы в разведении от 1:10 до 1:1000 обнаруживают противомикробное действие относительно 15 видов бактерий, вируса гриппа, некоторых грибков  и плесеней (не идентифицированы), а  также четырех видов простейших. В пробирочных опытах наблюдается  бактериостатический и бактерицидный  эффект в случае грамотрицательных  и особенно грамположительных микроорганизмов. Палочка Коха подавляется и в  эксперименте на животных (морские  свинки). При больших разведениях (1:10000) маточное молочко стимулировало  развитие бактерий.

Растворы маточного молочка  ускоряют прорастание семян и  рост ряда растений. Но из него выделено вещество, подавлявшее рост люпина.[6],[12]

Связь между составом маточного молочка  и его свойствами. Флуоресценция маточного молочка обусловлена птеринами; восстановительная способность, противомикробная и противоопухолевая активность, стимулирующее рост и развитие насекомых действие—10-окси-Δ2-деценовой кислотой. Витамины и фракция стеринов способствуют развитию и увеличению плодовитости животных. Аминокислоты ответственны за специфически динамическое действие маточного молочка. Фактор же, определяющий развитие из генетически однородной личинки матки или рабочей пчелы, не установлен.

Вещества, вызывающие изменения  в надпочечниках, печени и гипергликемию, относятся к жирорастворимой  фракции маточного молочка и  переходят в диэтиловый эфир или  ацетон. Но они не относятся к  органическим кислотам. Ацетилхолин  является нейрогормоном.

Применение. Клинические испытания показали, что маточное молочко при правильной дозировке оказывает на организм общеукрепляющее действие, стимулирует общий обмен веществ, повышает аппетит, усиливает природную сопротивляемость организма инфекции. Оно положительно влияет на работу нервной и сердечно-сосудистой систем, на состав крови (белково-солевой; эритроциты; содержание гемоглобина, холестерина, мочевой кислоты), оказывает регулирующее влияние на обмен липидов, деятельность желез внутренней секреции.

Маточное молочко показано для профилактики и лечения выраженного  преждевременного, ускоренного, осложненного одряхления с симптомами истощения  и возрастного снижения физиологических  функций и их регуляции у лиц 60—90 и более лет.

Маточное молочко используют: для лечения дистрофичных, недоразвитых, недоношенных грудных младенцев и детей в возрасте от 35 дней до 4 лет при отсутствии у них аппетита и нарушениях питания и пищеварения;при юношеских нарушениях развития (общая слабость, тетании, экссудативный диатез, хлороз); во всех случаях выздоровления и восстановления сил после тяжелых органических и инфекционных заболеваний, потерь крови, послеоперационных осложнений, облучения рентгеновскими или гамма-лучами; при психических, нервно-вегетативных, эндокринных астениях; заболеваниях, связанных с нарушением общего и липидного обмена (артериосклероз, атеросклероз, гиперхолистеринемия, диабет; нефрозы, патология щитовидной железы); воспалительных и рубцовых состояниях пищеварительного тракта (гастриты, хронические язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, панкреатит; воспаление желчного пузыря); при анемиях разного происхождения; гормональных кризах и нервно-психических заболеваниях (депрессии, навязчивые и тревожные состояния, неврозы); в дерматологии и пограничных областях косметики (кератозы, дерматиты, себоррея, псориаз), а также вводят в косметические кремы («Лада», «Нектар» и др.).

Маточное молочко применяют  в нативном состоянии, в виде растворов  или микстур, таблеток, пилюль, свечей, мазей, кремов, аэрозолей. Растворы его  готовят на воде или физиологической  среде (0,85%-ный раствор NaCl ) (1:1), 40%-ном этиловом спирте (1:9 или 1:20), сахарном сиропе, меде (1:100). Способы применения — внутрь, под язык, подкожно, внутримышечно; наружно — орошение, аппликации, электрофорез; путем ингаляции.[12],[16],[19]

Хранение.  Содержание или активность факторов и веществ, определяющих биологические свойства маточного молочка, зависят от его возраста, условий отбора, консервирования и хранения. Маточное молочко в целом и отдельные его компоненты неустойчивы против ряда воздействий. Стечением времени и под действием факторов окружающей среды биологическая активность и терапевтическая ценность нативного и даже законсервированного маточного молочка утрачиваются. Ослабевает со временем и противомикробное действие маточного молочка, находящегося в маточнике. При действии кислорода воздуха и света маточное молочко быстро теряет воду, окисляется, темнеет, плесневеет. Даже герметически укупоренное и в темноте оно при комнатной температуре за несколько недель приобретало желтовато-коричневый цвет и резкий запах. В целях консервирования маточное молочко смешивают с медом (от 1:20 до 1:100), сахарозой, молочным сахаром (1:4), глюкозой (1:20), медовым вином крепостью 13,5%, этиловым спиртом (40—45%-ным) или подвергают лиофилизации. Лиофилизованное маточное молочко сохраняет свои свойства в течение нескольких лет.

В маточном молочке, хранящемся при 2—4° С, образуются иногда кристаллы  кислот, не ухудшающие его свойств. Нагревая маточное молочко при температуре не выше 49° С и тщательно его перемешивая, кристаллы эти можно перевести в раствор.

Хранят его герметически укупоренным, без доступа воздуха  и света и по возможности при  более низкой температуре. Это относится  и к консервированному продукту. Высушенное лиофилизацией маточное молочко при указанных предосторожностях  можно хранить в течение 1—2 лет  и при комнатной температуре.[6]

Лекарственные формы: В разных странах выпущено более 20 препаратов маточного молочка, например апилак, аписерум, спиновит, витапинол, апилактоза, апиток, апитонус, витадон, колгель, мелькальцин, драже с маточным молочком, лиофилизированное маточное молочко во флаконах, лиофилизированное маточное молочко в ампулах и многие другие. В настоящее время Российской фармацевтической промышленностью выпускаются такие препараты на основе маточного молочка, как: апилак, апилактоза, апиток и апитонус.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Методики качественного и количественного  определения биологически – активных  веществ, содержащихся в маточном  молочке.

Экспертиза подлинности  маточного молочка основана:

1) на оценке содержания биоптерина (из секрета глоточной железы) и 10-окси-Δ2-деценовой кислоты (из секрета верхнечелюстной железы).

Подлинность молочка оценивают  по двум показателям — флуоресценции  и восстановительной способности.

1.А) Для наблюдения флуоресценции готовят водный раствор, содержащий от 0,010 до 0,025% сухих веществ маточного молочка (слабое и соответственно отчетливое светло-голубое свечение), рН его 4,0—4,2. Источником ультрафиолетового света служит ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления с фильтром УФС-3. Длина волны возбуждающего света 366 нм.

1.Б) Восстановительная способность маточного молочка обусловлена ненасыщенной 10-окси-Δ2-деценовой кислотой и родственными ей соединениями. В кислой среде эти вещества восстанавливают ион марганца в 0,1 н растворе перманганата калия. Для проведения реакции готовят водный раствор маточного молочка. При содержании в нем 1 мг сухих веществ маточного молочка обесцвечивание одной капли (0,035—0,040 мл) реактива наступает при комнатной температуре через 50 с, а при содержании 4 мг — мгновенно.

2) по содержанию в нем биологически или терапевтически действующего начала. Поскольку таковое неизвестно, оценку проводят с помощью биопробы, по косвенным показателям и по органолептическим признакам. Подразумевается и отчасти доказано, что утрата биологических свойств и уменьшение содержания известных нам компонентов маточного молочка отражает и соответствующее изменение его терапевтических свойств.

3) по органолептическим признакам - цвету, запаху, вкусу - маточное молочко должно отвечать соответствующим нормам при отсутствии признаков микробиологической порчи.[8],[15] Оно должно быть желтоватым и прозрачным, молочно-белым или бело-желтоватым. Маточное молочко должно содержать от 1,9 до 2,5% азотсодержащих соединений, от 9 до 13% сахаров и менее 1,5% минеральных веществ. Оно является коллоидным и вязким, имеет слабый вкус и очень вяжет. Чем более прозрачное и блестящее, тем оно свежее. Маточное молочко темнеет с течением времени или под действием воздуха во время сбора и фильтрации. Оттенок света маточного молочка фактически обусловлен его старением и химическим преобразованием деценовой кислоты, которая реагирует с другими кислотами, содержащимися в продукте. Избыточная вязкость, низкие вяжущие свойства и очень сильный запах отражают потерю свежести. Его рН должен лежать в пределах 3,5-4,5, и в нем не должно обнаруживаться присутствия тетрациклина. Присутствие тяжелых металлов и мышьяка разрешено в пределах максимальных значений, равных 5 и 1 промилле, соответственно. Оно также обычно подвергается серии испытаний, таких как контроль показателя преломления, измерение ферментативной активности, анализ на растворенные белки и даже измерение содержания ацетилхолина и холина. Оно не должно содержать таких загрязнений, как фрагменты личинок или воска, а при добавлении воды оно начинает опалесцировать за счет присутствия веществ в виде суспензии. [3],[6]

При экспертизе подлинности  и качества маточного молочка, как  исходного сырья, а также его  препаратов, осуществляемой на предприятиях по переработке этого продукта, руководствуются  действующей нормативно-технической  документацией.

В настоящее время также  существует межгосударственный стандарт ГОСТ 28888-90 «Межгосударственный стандарт. Маточное молочко. Технические условия» для определения подлинности  и качества маточного молочка.  Однако данный стандарт распространяется на маточное молочко, применяемое в  пищевой промышленности.

Для качественного и количественного  определения биологически – активных веществ в маточном молочке используют физико – химические методы.

Физико-химические или инструментальные методы анализа основаны на измерении  с помощью приборов (инструментов) физических параметров анализируемой  системы, которые возникают или  изменяются в ходе выполнения аналитической  реакции.

Ряд современных физико-химических методов анализа позволяют одновременно в одной и той же пробе выполнять как качественный, так и количественный анализ компонентов. Точность анализа современных физико-химических методов сопоставима с точностью классических методов, а в некоторых, например в кулонометрии, она существенно выше[13].

К недостаткам некоторых  физико-химических методов следует  отнести дороговизну используемых приборов, необходимость применения эталонов. Поэтому классические методы анализа по-прежнему не потеряли своего значения и применяются там, где  нет ограничений в скорости выполнения анализа и требуется высокая  его точность при высоком содержании анализируемого компонента.

В основу классификации физико-химических методов анализа положена природа  измеряемого физического параметра  анализируемой системы, величина которого является функцией количества вещества. В соответствии с этим все физико-химические методы делятся на три большие  группы:

- электрохимические;

- оптические и спектральные;

- хроматографические.[13]

Для количественного определения  биологически – активных веществ  в маточном молочке используют хроматографические физико – химические методы анализа, а именно ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ.

1) Методом ТСХ происходит разделение эфирорастворимой фракции липидов маточного молочка. Для проведения данного метода в качестве подвижной фазы используют гексан – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота( 73:25:2); в качестве сорбента – Силуфол УФ – 251.

2) Методом ГЖХ происходит  разделение жирных кислот.

3) методом ВЭЖХ для  идентификации, определения качечтва  и количественного определения  биологически – активных веществ  в маточном молочке. Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин). Высокая селективность, чувствительность и экспрессность данного метода позволяют эффективно использовать его для стандартизации маточного молочка и препаратов на его основе. [6].[8],[15]