Влияние вариабельности физиологических и цитолого-биохимических характеристик на радиочувствительность семенного потомства ольхи

a - токоферол

Токоферолы, в особенности альфа-токоферол (vit Е) перехватывает и инактивирует радикал ОН^•, тем самым, обусловливая обрыв цепей перекисного окисления. Глютатионпероксидаза, разрушающая липидные перекиси, не проникает в гидрофобные зоны, то есть внутрь липидного бислоя. Лишь присутствие в нем токоферолов и каротиноидов лимитирует развитие перекисного окисления липидов. В водных фазах и компартментах клетки антиоксидантную защиту осуществляют аскорбиновая кислота, а также цистеин и глютатион - наиболее важные из ряда тиоловых соединений. Система аскорбиновой кислоты дополняется главным образом у растений буферной системой фенолсемихинон-хинон, стабилизирующей содержание аскорбата в жидкостях и тканях организма и способствующей сохранению окислительного гомеостаза в нем в условиях активной жизнедеятельности. Следует иметь в виду, что системы водорастворимых антиоксидантов имеют ограниченный «антиоксидантный потенциал», т.к. их действие заключается в делокализации по структуре свободного электрона радикала. Каждая состоит из восстановленного и окисленного членов и интермедиата радикальной природы. Поэтому при значительной нагрузке активными формами кислорода их антиоксидантный эффект может не только исчерпываться, но и переходить в свою противоположность, то есть приводить к усилению свободнорадикальной атаки биомембран (Петрусевич и др., 1966; Владимиров и др., 1972; Барабой, 1992).

Системы синтеза антиоксидантов, поступление с пищей не синтезируемых в организме соединений (витамины С, Е, Р, А, К), а также регенерация окисленных членов окислительно-восстановительных антиоксидантных систем в норме компенсирует образование радикальных инициаторов перекисного окисления и предотвращает неконтролируемое автокаталитическое накопление в средах организма токсических продуктов перекисного окисления. При действии на организм того или иного экстремального  агента, сила и длительность воздействия которого выводят организм за пределы условий обычной жизнедеятельности, окислительно-антиоксидантное равновесие смещается в направлении доминирования, активации перекисного окисления.

Достоверный защитный антиоксидантный эффект был  получен с солями галловой кислоты, катехинами, галаскорбином (Меерсон, 1981; Журавлев, 1982; Барабой, 1992). Было установлено, в частности, что ингибиторы свободнорадикальных процессов вызывают обратимое угнетение активности окислительных ферментов, энзимов гликолиза, тормозят радиационную деполяризацию ДНК, угнетают биосинтез нуклеиновых кислот. Фенольные антиоксиданты проявляли также антимутагенную активность и способность защищать геном от лучевого поражения. Очевидно, при этом имеет место непосредственное взаимодействие фенольных антиоксидантов с биополимерами клетки, в итоге, которого достигается “разрядка” возбужденных электронных и радикальных состояний последних с отводом избыточной энергии и с восполнением электронных вакансий. В этом последнем процессе радиопротектор выступает в роли донора электронов. Введением фенольных антиоксидантов не только перед воздействием радиации, но и в ранние сроки после него удается ослабить лучевое поражение организма (Меерсон, 1981; Журавлев, 1982; Барабой, 1992).

Отсутствие  у живых организмов рецепторов для восприятия ионизирующей радиации исключает возможность запуска стереотипной стресс-реакции. Запуск неспецифической реакции осуществляется во всех случаях в результате первичного поражения биомембран, нарушения ионного баланса в клетках, изменения ионного транспорта и последующего снижения конформационной подвижности макромолекул. Двухфазный характер реакции стресс-реализирующих систем на уровне про-антиоксидантного равновесия при лучевом поражении объясняется воздействием экстремальных агентов: собственно радиации, индуцирующей развитие реакции липопероксидации биомембран и свободнорадикальнах процессов в водных фазах организма, развертывание клиники лучевого поражения радиочувствительных систем, индуцирующей в свою очередь массовую гибель клеток и вторичную активацию перекисного окисления липидов (Меерсон, 1981; Алексеев и др., 1983; Барабой и др., 1992; Журавская и др., 1995).

1.6.  Радиоустойчивость семян

Исследования  Е.И.Преображенской  (1971) и Д. М. Гродзенского (1989) показали, что радиоустойчивость семян зависит от  размера, недоразвитости зародыша, возраста семян, а также от числа хромосом, их размера и объём интерфазного ядра. Большую роль в формировании радиочувствительности играют содержание жира, кислород, влажность, температура, биохимический состав семян, а также эколого-географический факторы (место репродукции происхождение сортов и подвидов).

1.6.1.Механизмы радиоустойчивости

Устойчивость  растений к действию радиации может  определяться рядом факторов, как на молекулярном, так и на более высоких уровнях организации:

1. Степень  радиационного повреждения молекул  ДНК в клетке уменьшают системы восстановления ДНК, независимые (темновая репарация) или зависимые от света. Системы темновой репарации ДНК, постоянно присутствующие в ДНК, отыскивают поврежденный участок, разрушают его и востанавливают целостность молекулы ДНК. Под влиянием света ферментативным или неферментативным путем устраняются димеры пиримидиновых оснований, возникающие в ДНК при действии ультафиолетого света или ионизирующего излучения. Такого рода восстановление целостности ДНК способствует также уменьшению повреждений (изменений) и в хромосомах.

2. Защиту  на уровне клетки осуществляют  вещества-радиопротекторы. Их функция  состоит в гашении свободных  радикалов, возникающих при облучении, в создании локального недостатка кислорода или в блокировании реакции с участием продуктов - производных радиационно-химических процессов.

Функцию радиопротекторов выполняют сульфгидрильные  соединения (глутатион, цистеин, цистеамин и др.) и такие восстановители, как аскорбиновая кислота; ионы металлов и элементы питания (бор, висмут, железо,калий, кальций, кобальт, магний, натрий, сера, фосфор, цинк); ряд ферментов и кофакторов (каталаза, пероксидаза, полифенолоксидаза, цитохром с, NAD); ингибиторы метаболизма (фенолы, хиноны); активаторы (ИУК, кинетин, гибберелловая кислота) и ингибиторы роста (абсцизовая кислота, кумарин) и др.

3. Восстановление  на уровне организма обеспечивается  у растений (Полевой, 1989; Сойфер, 1997).:

а) неоднородностью популяции делящихся клеток меристем, которые содержат клетки с разной интенсивностью деления;

б) асинхронностью делений в меристемах, так что  в каждый момент в них содержатся клетки на разных фазах митотического  цикла с разной радиоустойчивостью;

в) существованием в апикальных меристемах фонда клеток типа покоящегося центра, которые приступают к энергичному делению при остановке деления клеток основной меристемы и восстанавливают как инициальные клетки, так и меристему; г) наличием покоящихся меристем типа спящих почек, которые при гибели апикальных меристем начинают активно функционировать и восстанавливают повреждение.

Все эти механизмы защиты и восстановления не являются специфичными только для растений и поэтому их изучение важно для решения проблемы радиоустойчивости как растений, так и других живых организмов (Гродзинский, 1983; Хочачка и др., 1988; Алексеев, 1994; Ленинджер, 1974; Преображенская, 1971; Федорова, 2001; Журавская, 2001).

В растениях  Якутии было обнаружено  повышенное  содержание  ферментов,  выполняющих  антиоксидантные  функции по инактивации свободных радикалов и перекисей: полифенолоксидаз, пероксидаз, супероксиддисмутазы, каталазы (Алексеев и др., 1983; Ксенофонтова, 1994; Журавская и др.,1995). Следует отметить, что перестройки метаболизма (прежде всего геномные) (Магомедов и др., 1980; Кершенгольц, Журавская, 1997а), направленные  на  адаптацию  растений к условиям резко-континентального климата Якутии,  должны существенно влиять и на  их  радиочувствительность.  С  одной стороны,  диспергированность хроматина ядра  клеток семян растений Якутии должна привести  к  снижению радиоустойчивости, а с другой обогащенность их ферментативными и низкомолекулярными антиоксидантами, включая флавоноиды, низкомолекулярные  алифатические спирты и альдегиды - к росту радиоустойчивости.

В результате адаптации растительных организмов к условиям криолитозоны, в том числе к короткому вегетационному сезону, в тканях ряда дикорастущих растений, произрастающих на территории Якутии, формируется большое изоструктурное разнообразие и увеличивается количественное содержание биологически активных веществ(Кершенгольц, 1995). Это позволяет использовать их в качестве биологически активных добавок в пищевой, косметической и других отраслях промышленности (Журавская, 1993а,б; 1995, Кершенгольц и др, 1997а,б; Нуреева и др., 1999, 2000; Филиппова и др, 2002а,б, 2003а,б). Установлено, что экстракт Artemisia jacutica обладает выраженным радиопротекторным действием, которое проявляется в поколениях от F₁ и F₃. При применении экстракта Rododendron aureum защитное действие проявляется в поколении F₂ (пострадиационная обработка) и в поколении F₃ (предрадиационная обработка) (Филиппова, 2003а). Комплексы биологически активных веществ из тканей полыни чернобыльник и рододендрона золотистого гетерогенны по составу и содержат антиоксиданты, активаторы ДНК-репарационных систем и трансляции, ингибиторы репликации. Установлено, что проращивание семян пшеницы (предварительно обработанных 1 мМ растворами Pb²⁺) в разбавленных экстрактах полыни чернобыльник (1:25÷1:50) и рододендрона золотистого (1:50); и пред-, пострадиационная обработка экстрактом рододендрона золотистого семян дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного оказывает защитное действие, активируя системы репарации ДНК и (или) антиоксидантной защиты. Это приводит к снятию токсического действия Pb²⁺ и радиации (Шаройко, 2003; Федорова, 2003).

Сделанный прогноз связи физиолого-биохимических  перестроек в клетках растений при  их адаптации к экологическим  условиям Якутии с их стрессоустойчивостью позволяет предположить, что вещества,  эндогенно вырабатываемые для повышения устойчивости растений к условиям экстремального климата Якутии, могут обладать  протекторными свойствами по отношению к ним самим и другим организмам при стрессирующей реакции. 

1.6.2. Внутривидовая радиочувствительность

Внутривидовая изменчивость организмов к действию факторов среды  изучается давно (Шварц, 1963;  Мамаев, 1972; Семкина, 1985). Большая часть работ  посвящена реакции на морфологическом и анатомическом уровнях отдельных индивидуумов на действие температур, различных солей, и др. (Веселова и др., 1993; Захаров и др., 2000). Данных, позволяющих расширить представление о виде по дифференциации отдельных организмов в популяции по радиоустойчивости, очень мало (Позолотина, 1980; Тихомиров, 1985; Журавская, 2001; Талалаева, Позолотина, 2006).

1.6.3. Влияние внутривидового  адаптационного   потенциала   на

радиочувствительность растений

В работе А.Н. Журавской (2001)  было прослежено, каким образом изменяется радиочувствительность ряда видов дикорастущих и культурных растений Якутии, в зависимости от внутривидового разброса индивидуальной всхожести  индивидуумов и некоторых биохимических параметров (в частности, содержание и структурное разнообразие антиоксидантов), составляющих выборку вида. Было установлено время (месяц) максимальной и минимальной всхожести семян у  4-х изученных видов растений. Смесь семян в период минимальной и максимальной всхожести была облучена g-квантами ⁶⁰Со в диапазоне от 0,5 до 500 Гр.

Установлено, что в  период минимальной всхожести семян (у дескурайнии Софьи - февраль; у иван-чая узколистного - август; у ольхи кустарниковой и  березы растопыренной  - январь) наблюдалась низкая дисперсия этого признака, которые обратно коррелировали со значениями квазипороговых доз. А в месяцы (январь, июль, декабрь, ноябрь, соответственно), когда семена растений находились в активном состоянии,  они имели высокую всхожесть и радиочувствительность их увеличилась.

Таким образом,  была установлена связь между амплитудой колебания годовой всхожести семян, ее дисперсией и радиоустойчивостью исследуемых растений. Также было установлено, что внутривидовая адаптация к условиям обитания (в том числе к экстремальным), во-первых,  происходит за счет расширения структурно-функционального разнообразия биологически активных веществ (в первую очередь – низкомолекулярных антиоксидантов), которое часто прямо коррелирует с физиологическими показателями  организма (например, со всхожестью семян, ее дисперсией, то есть с внутривидовым разнообразием организмов). Во-вторых, за счет функциональной активности систем антиоксидантной защиты и репарации ДНК. Если же адаптация приводит только к увеличению функциональной активности, а не к внутривидовому разнообразию, то по всей вероятности формируется специфическая адаптация. При этом увеличивается неспецифический (и специфический) адаптивный потенциал организма, его интегральная устойчивость, что напрямую может влиять на формирование радиоустойчивости вида.

На примерах гексаплоидных пшениц, выращиваемых в Якутии и на Урале, была изучена внутривидовая изменчивость радиочувствительности у разных сортов пшеницы, а также роль климатических условий в проявлениях этого феномена (Журавская и др., 1992). Проведенное  обследование показало широкий диапазон радиационного полиморфизма у некоторых сортов пшеницы, выращиваемых в Якутии и на Урале, и корреляцию этого свойства с уровнем хромосомных аберраций, антиоксидантной защитой и функциональной активностью генома  клеток корневой меристемы проростков. Установлен диапазон изменчивости радиочувствительности некоторых сортов пшеницы, произрастающих в условиях Якутии: наиболее чувствителен сорт «Победа», наиболее устойчивы «Скала» и «Приленская 19». Также показано, что радиочувствительность  сорта «Скороспелка улучшенная», оцененная по физиологическим, цитогенетическим и биохимическим параметрам, не зависела от климатических условий формирования семян.

В. Н. Позолотина. в работе (1980) экспериментально изучала внутривидовую изменчивость радиочувствительности семян берёзы бородавчатой и берёзы пушистой. Целью данной работы ставила – оценить внутривидовую изменчивость радиочувствительности семян двух видов берёзы и сравнение по этому показателю диплоидный вид берёзу бородавчатую и тетраплоидный вид берёзу пушистую. Данные по индивидуальной изменчивости всхожести семян берёзы бородавчатой без облучения и при облучении их максимальной дозой 40 крад  показали, что в первом варианте всхожесть семян, собранных с разных деревьев, различается незначительно. Предпосевное облучение вызывает повышение вариабельности всхожести семян, что свидетельствует о неоднородности выборки по радиочувствительности входящих в неё организмов. Дисперсионный анализ подтвердил достоверную линейную зависимость всхожести семян от дозы облучения, а также достоверные различия в реакции на облучение семян собранных с разных деревьев. В данной выборке условно были выделены три группы деревьев: радиоустойчивые (например №2, 6 и 7), радиочувствительные (№3), остальные занимающие промежуточное положение.

Сравнение данных по всхожести семян и выживаемости сеянцев позволяет выявить некоторые индивидуальные особенности семян, собранных с разных деревьев, в проявлении радиационного эффекта. Так, у некоторых деревьев (например №3), под воздействием больших доз радиации значительная часть семян не всходит. У других деревьев (№2), несмотря на высокие дозы облучения, семена прорастают и развёртывают семядоли, но возникшие в них при облучении повреждения препятствуют дальнейшему развитию. И через 1-1,5 месяца, наблюдается массовый отпад сеянцев. Всхожесть семян и выживаемость сеянцев не всегда коррелируют между собой. В отличие от диплоидного вида, у тетраплоидной берёзы пушистой в контроле наблюдаются существенные различия по всхожести семян. Вариабельность всхожести семян и выживаемости сеянцев возрастает после предпосевного облучения в дозах 20 и 40 крад. Дисперсионный анализ подтвердил значимость различий у семян, собранных  с разных деревьев, по их реакции на облучение, а также достоверную зависимость всхожести семян от дозы облучения. Выживаемость сеянцев берёзы пушистой коррелирует со всхожестью семян. По обоим показателям в выборке можно выделить группу деревьев, семена с которых более устойчивы к действию радиации (например, №1, 3 и 5), менее устойчивы семена с деревьев №4, 6. С экологической точки зрения представляет интерес сравнение характера генотипической индивидуальной изменчивости радиочувствительности семян у этих двух видов берёзы. Характеристика радиочувствительности взрослых деревьев по радиочувствительности собранных с них семян относительна, однако эта методика может позволить оценить изменчивость радиочувствительности в пределах насаждения и сравнить по этому показателю разные виды. Анализ обширного фактического материала позволил предположить, что в полиплоидных рядах существует оптимальный по радиорезистентности уровень плоидности, различный для разных видов (Дубинин и др., 1971). Высокая радиоустойчивость на оптимальном уровне плоидности может обеспечиваться у разных видов различными механизмами: геномной или «физиологической» защищенностью, большей концентрацией защитных веществ или высокой интенсивностью репарационных процессов. Результаты экспериментов свидетельствуют об отсутствии существенных различий в дозовой зависимости у диплоидной березы бородавчатой и тетраплоидной березы пушистой по избранным критериям.