Влияние вариабельности физиологических и цитолого-биохимических характеристик на радиочувствительность семенного потомства ольхи

– в процессах репликации  на стадии IV  (схема 2.1) – по величине митотического индекса;

– в процессах репарации на стадиях III и IV клеточного цикла – по разнице между общей активностью генома во всех реакциях синтеза фрагментов ДНК, характеризуемой скоростью включения ³Н-тимидина в молекулы ДНК, и активностью генома в реакциях биосинтеза дочерних молекул ДНК, характеризуемой величиной митотического индекса (схема 2.1)

Схема 2.1

трансляция

                     ДНКм  ®  м-РНК ®  белок (фермент)

  репликация               репарации 

 

                                   мутагены

                     ДНКд                         ДНКд*

 

Для того чтобы эти параметры, измеряемые в разных размерностях, можно было бы сравнивать между собой (например, скорость включения ³Н-тимидина и митотический индекс),  нормировали их по отношению к контролю (среднее значение по выборке).

При этом, в первом приближении,  активность генома характеризовалась в реакциях: трансляции – нормированной величиной [включение ¹⁴С-лейцина]_N;  репликации – нормированной величиной [митотический индекс]_N;  репарации – нормированной величиной ([включение ³Н-тимидина]_N – [митотический индекс]_N). Общая активность генома описывалась величиной ([включение ¹⁴С-лейцина]_N + [включение ³Н-тимидина]_N + [митотический индекс]_N).

Устойчивость генома пропорциональна, во-первых, активности антиоксидантных систем (k_АОЗ), инактивирующих наиболее активные вторичные мутагены – свободные радикалы и перекиси, во-вторых, активности систем репарации ДНК, и обратно пропорциональна объему, занимаемому нуклеопротеидом ДНК, степени его диспергированности. В свою очередь этот параметр пропорционален общей активности генома. Поэтому приведенная схема позволила вывести коэффициент устойчивости генома (k_уст) клеток в отношении любых по природе мутагенных воздействий:

                       

                           (³H-тимидин)_N– (МИ)_N

 k_уст = k_аоз + ––––––––––––––––––––––––––––;                                 

                          (³H-тимидин)_N+ (¹⁴С-лейцин)_N

 

 

2.7. Определение  активности  пероксидазы

Определение проводили  по стандартной методике (Асатиани, 1969). Субстрат – ароматический амин – о-дианизидин, который при окислении пероксидом водорода образует окрашенный продукт с максимумом поглощения при 460 нм (e_экст. = 3 * 10⁴ М^-1 см^-1). Активность фермента регистрировали по накоплению во времени продукта окисления о-дианизидина.

Проростки взвешивали на аналитических весах «Mettler AM100» с точностью ±0,1. Гомогенизировали в ступке с 2-4 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера рН=7,4. Центрифугировали в течение 10 минут. Для исследования брали супернатант. Реакционная смесь в кювете состояла из 2,3 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера рН=7,4; 0,1 мл 0,05 М раствора пероксида водорода; 0,1 мл 0,1 М раствора о-дианизидина. Пероксидазную реакцию инициировали введением 0,1 мл вытяжки из проростков. Контрольную реакцию проводили аналогичным образом, кроме введения вытяжки. Активность пероксидазы (АП; мкмоль/(г мин) рассчитывали по формуле (4): вычитая скорость контрольной реакции из изменения оптической плотности в минуту в опытной кювете. Полученный результат нормировался на грамм исходной ткани.

АП = (dD/dt) * V_гом / e_экст * V_внес* m                                          (4)

 

Где: dD/dt – разница  между изменениями оптической плотности  в 1 мин, в опытной и контрольной  пробах;

      V_гом – объем буфера, используемый для гомогенизации, мл,

      V_внес – объем экстракта, используемый для исследования, мл,

      m – масса  исследуемого материала, г.

     e_экст. = 3,0 *10⁴ М^-1 см^-1

 

2.8. Определение активности  супероксиддисмутазы (СОД)

Определение активности СОД основано на инактивации супероксидрадикала (*O₂^-) этим ферментом (Constantine and all, 1977).

Экстракцию СОД проводили следующим  образом. Навеску корешков проростков  гомогенизировали в 0,1 М Na-карбонатном  буфере рН=10,2. Гомогенат центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут. Супернатант сливали в пробирку и хранили на холоду, в темноте.

 

Схема реакции следующая:

 

     Метионин+Рибофлавин             NBT  ®   NBT_восст.

О₂––––––––––––––––––––––® ^·О₂–––––––––––––––––––––––––О₂

                                                                                      ¯                  СОД

                                                                        Н₂О

                                                                         ¯

                                                                        Н₂О₂

 

Т.е. чем больше активность СОД, тем меньше образуется окрашенного продукта – восстановленного тетранитротетразолиевого синего (NBT восст.) или бисформазана.

Реакционная смесь состояла из: 0,1 мл (39,05 мкмоль/л) рибофлавина, 0,2 мл (122,3  ммоль/л) метионина, 0,1 мл (1,7 ммоль/л)NBT, 2,5 мл 0,1 М Na-карбонатного буфера рН=10,2 и 0,1 мл экстракта. Определяли начальную оптическую плотность при l=560 нм. Затем кювету с реакционной смесью освещали люминесцентной лампой в течение 5 минут и измеряли (ΔD₅₆₀)_опыт. Определение (ΔD₅₆₀)_контр. проводили также, но без внесения экстракта. Активность СОД (мкмоль/г мин) рассчитывали по формуле:

                       [Δ ((D₅₆₀)_{контр. -}  (D₅₆₀)_опыт )) / Δt] * V₁ *V₂ *10³

Акт. СОД =-------------------------------------------------------          

                                            V₃ * e₅₆₀ * m

где:V₁ – объем суммарный объем реакционной смеси,

       V₂ – объем буферной смеси, используемый для

         гомогенизации и экстракции проростков, мл,

       V₃ – объем экстракта, вносимый в реакционную смесь и

                 используемый для анализа, мл,

       m –  масса исследуемого материала,  г.

       e₅₆₀ – молярный коэффициэнт экстинции

                  бисфармазана 3,98*10 ³ M ^-1 cm ^-1

Коэффициент суммарной антиоксидантной защиты (k_аоз)  рассчитывали как среднее арифметическое (x) нормированных к контролю показателей ее составляющих (пероксидазы, СОД, НМАО). Показатели в контрольной (среднее значение по выборке) точке условно принимались за единицу.

 

2.9. Цитологический анализ [Паушева, 1974]

Проращивание  семян. Для определения показателя митотического индекса (МИ) использовали меристематическую ткань корешков  проростков  в виде давленых препаратов. Семена  высевали в чашки Петри, на фильтры,  при комнатой температуре для прорастания. По достижении корешками длины 5 – 7 мм  их фиксировали в уксусном алкоголе фиксатор Кларка.

Методика  приготовления  давленых  препаратов. Зафиксированные, промытые в 55% уксусной кислоте, корешки помещали на предметное стекло в каплю молочной кислоты.  Бритвой осторожно отрезали кончик корня, накрывали покровным стеклом и  фильтровальной  бумагой.  Затем  раздавливали нажатием большого пальца руки так,  чтобы клетки корня распределились в  один  слой. При необходимости постукивали сверху спичкой.

Методика  фиксации,  сохранения  и   мацерации   корешков.   Под фиксацией материала понимают процесс быстрой гибели клеток в специально подобранных растворах ядовитых реактивов,  которые называются фиксаторами.  Фиксация прерывает тот или иной  процесс в клетке, вызывая необратимые изменения. При этом коллоиды протопласта переходят в нерастворимое состояние. Для изготовления давленых препаратов нами был использован фиксатор – уксусный алкоголь (фиксатор Кларка),  который готовили из 96%-ного этилового спирта и ледяной уксусной кислоты,  смешивая их в  соотношении  3:1.  Данный ядерный фиксатор широко применяется в цитологических и эмбриологических исследованиях,  особенно для изготовления давленых препаратов.

В цитологических  исследованиях  обычно  используется ледяная уксусная кислота,  имеющая 99,8% основного вещества и при охлаждении образующая кристаллическую массу. Эта кислота, быстро проникая в ткани,  может вызывать их набухание, она хорошо осаждает нуклеиновые кислоты.  Этиловый спирт быстро проникают в ткани,  позволяя красителю провести окрашивание.

Корешки проростков,  длиной до 5-7 мм помещали в пенициллиновые пузырьки, заливая их изготовленным  фиксатором.  Материал выдерживали в фиксаторе не менее 12 часов, в холодильнике.

При изготовлении  давленых  препаратов  исключительное значение имеют различные способы мацерации  тканей.  От  степени  мацерации часто зависит качество изготовленного препарата.  Мацерацию проводили несколькими каплями 1н HCl и небольшим  нагревом  на  пламени спиртовки.

Методика  окрашивания  препаратов  ацетоорсеином. Для окрашивания  ядер  меристематической ткани корешков  использовали ацетоорсеин.

Приготовление ацетоорсеина: 1 г.  орсеина растворяют в 45 мл горячей уксусной кислоты и добавляют после остывания 55 мл дистиллированой воды. После тщательного взбалтывания и фильтрации раствор готов к употреблению (Паушева, 1974).

Фиксированные корешки заливали  на  часовых  стеклах  готовым красителем. Затем добавляли 4-5 капель 1н HCl, слегка подогревали, закрывали другим стеклом  и  оставляли  препарат  окрашиваться  на 20-24 часа.

Методика  просмотра  препарата. Приготовленный препарат вначале мы  рассматривали при малом увеличении  (90).  Во избежание повторных просмотров проанализированных участков препарата при анализе и подсчете клеток меристематической ткани существует определенная методика просмотра препаратов, которая заключается в том, что необходимо двигать столик микроскопа (при этом наблюдая за объектом в окуляр) начиная слева направо,  затем сверху вниз  и опять справа налево,  охватывая, таким образом, все клетки участка растущей ткани. Что мы неукоснительно соблюдали.

 

2.10. Статистическая  обработка результатов

Эксперименты  проводили в 4-х повторностях, по 100 штук семян в каждой. Анализ и оценку  достоверности результатов, построение вариационных кривых,  вычисление коэффициентов корреляции проводили по (Лакин, 1980). Вариабельность показателей вычисляли, используя коэффициент вариации по формуле:

V=σ/x·100%, где

 σ - среднеквадратическое отклонение;

 х - среднеарифметическое значение.

При определении биохимических параметров статистический разброс определяли путем введения 1% ошибки на измерение, на цитологические параметры – статистический разброс 5% ошибки на метод, для физиологических параметров - статистический разброс  10% ошибки на метод.

Нормирование  значений для расчета коэффициентов проводилось путем деление натуральной величины на среднее по выборке (Лакин, 1980).

 

 

 

 

3. Результаты и обсуждение

 

Цель данного исследования - выявить влияние вариабельности физиологических и цитолого-биохимических характеристик, сформированных у ольхи кустарниковой при произрастании в условиях хронического облучения повышенным естественным радиационным фоном, на   радиочувствительность ее семенного потомства.

 

3.1. Влияние повышенного  естественного радиационного фона  на массу семян и их всхожесть

На  рис.3.1А представлены данные, показывающие изменение средней массы семян  ольхи кустарниковой в зависимости  от γ-фона ее произрастания. Видно, что  средняя масса семян (340,0 мг), выросших при 700 мкР/ч, статистически неотличима от средней массы семян (350,0 мг), выросших при 20 мкР/ч (контроль). Следует отметить, что средняя масса семян (300,0 мг), выросших при 300 мкР/ч,  меньше на 14 - 12%, чем при 20 и 700 мкР/ч, соответственно. Средняя масса семян, сформированных при 300 мкР/ч,  статистически достоверно отличимая от массы семян, выросших при 20 и 700 мкР/ч.

На  рис.3.1Б показаны вариационные кривые распределения массы семян индивидуальных растений ольхи кустарниковой, выросших при фоне 20, 300 и 700 мкР/ч.   Анализ вариационной кривой  растений с фона 20 мкР/ч  (контроль) показал, что распределение массы семян шло неоднородно, вариационная кривая имеет куполообразную структуру мода которой относится к классу 196-391мг. Кривая распределения массы семян растений, выросших в условиях 700 мкР/ч, схожа по характеристикам с контрольной выборкой. Следует отметить, что количество частот растений данной выборки, имеющих массу семян в диапазоне от 196-391 мг, увеличилась на 14% за счет отсутствия растений с минимальной массой семян (0-195 мг). Вариационная кривая распределения массы семян растений, выросших при фоне 300 мкР/ч показала, что все исследованные нами растения дали семена приблизительно одинаковой массы и вошли в категорию «196-391 мг».

На  рис.3.2 показаны вариационные кривые распределения  всхожести семян индивидуальных растений ольхи кустарниковой, выросших в условиях радиационного фона. Анализ вариационной кривой  показал, что всхожесть у растений контрольной группы (20 мкР/ч) находится в интервале нормированных значений от 0,8 до 1,1. Вариационные кривые распределения всхожести семян растений, выросших на фоне 300 и 700 мкР/ч, показали удвоение моды кривой.

Показано, что произрастание ольхи кустарниковой в условиях повышенного естественного радиационного фона 700 мкР/ч статистически достоверно не изменило среднюю массу семян относительно контроля. А произрастание в условиях 300 мкР/ч привело к уменьшению средней массы семян. Это связано с длительным существованием ольхи кустарниковой в условиях ПЕРФ что, привело к «стандартизации» массы семян.