Культивирование микроорганизмов

Пивное сусло  и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании), получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окрашивания с иодом). Пробы на осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости.

Сусло процеживают через  вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10—20% сахара. Точное его содержание определяют по плотности раствора при помощи сахариметра. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6 — 8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе.

Для приготовления сусло-агара  к пивному суслу добавляют 2,5 — 3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.

Обезжиренное  молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.

При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться.

Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30 °С, чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.

При стерилизации в автоклаве  иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизации казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретое побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.

Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50—100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.

Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды; добавляют 2 г Na₂HPO₄, каплями 1 н. раствор NaOH (до рН 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 сут, доводят раствором NaOH до рН 7,4, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве 30 мин при давлении пара 1,5 атм.

 

4.2. Методы стерилизации

Стерилизация, или обеспложивание (от лат. Sterilis — бесплодный), — это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Известно несколько  методов стерилизации: физический, механический и химический. Чаще всего применяют физический метод стерилизации - стерилизацию нагреванием.

 

4.2.1. Фламбирование,  или прокаливание

Прокаливать можно непосредственно  перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т. д.

 

4.2.2. Стерилизация  сухим жаром

 

Ее применяют для  обработки посуды и сухих материалов, например крахмала, мела. При этом стерилизуемый объект выдерживают при 170 °С в течение 2 ч (считая с того момента, как установлена необходимая температура) в печи Пастера (Рис.7, а) или в электросушильных шкафах. Поднимать температуру выше 170 °С не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться (буреют, становятся ломкими).

Перед стерилизацией  стеклянную посуду закрывают ватными  пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пипетки, вату, марлю заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых стерильная посуда может храниться после стерилизации.

По окончании стерилизации шкаф открывают только после того, как температура снизится до комнатной, иначе стекло может лопнуть.

 

4.2.3. Стерилизация  текучим паром

 

Текучим паром (100 °С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко). Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха (Рис. 7, б) по 30 мин в течение 3 сут ежедневно. Такая стерилизация называется дробной.

Кипятильник Коха — высокий металлический цилиндр с двойным дном, свободно закрывающийся конусообразной крышкой с отверстием для термометра. Снаружи цилиндр покрыт асбестом или линолеумом. На дно кипятильника наливают воду, устанавливают подставку с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые предметы. Продолжительность стерилизации отсчитывают с момента интенсивного выхода пара из-под крышки и повышения температуры до 100 °С.

При однократном прогреве при температуре 100 °С в течение 30 мин погибают вегетативные клетки, споры же многих микроорганизмов  остаются жизнеспособными. После такого прогрева среду помещают на 24 ч в термостат при 28 - 30 °С. Споры, сохранившиеся при первом нагревании, успевают за это время прорасти в вегетативные формы, которые погибают при последующем нагревании. Затем эту операцию повторяют еще 2 раза.

Рис. 7. Оборудование для  стерилизации:

а — печь Пастера; б — кипятильник Коха

На массивной крышке или сбоку котла находятся  кран для выхода пара, манометр и  предохранительный клапан. Манометр показывает, на сколько давление пара внутри котла выше нормального. Для предотвращения взрыва при превышении предельного давления срабатывает предохранительный клапан, давая выход пару.

Показателю манометра  в физических атмосферах соответствует определенная температура.

Давление, атм Температура, 

0,5                    115 

1,0                    120 

1,5                    127 

2,0                    133 

Надежной стерилизации достигают нагреванием при 120 °С и давлении 1 атм в течение 20 мин.

Стерилизацию ведут следующим  образом. Наливают воду в автоклав, помещают в него стерилизуемые предметы, завинчивают крышку автоклава и начинают подогрев. Кран оставляют открытым до тех пор, пока весь воздух, находящийся в автоклаве, не будет вытеснен парами воды. Когда пар начнет выходить из крана непрерывной струей, кран закрывают, доводят давление пара в автоклаве до 1 атм и поддерживают на этом уровне 20 — 30 мин. Затем нагрев прекращают, ждут, пока стрелка манометра опустится до 0, осторожно (понемногу) открывают кран и спускают пар. Только потом отвинчивают крышку автоклава. Если кран открыть раньше, чем упадет давление, то жидкость в стерилизуемых сосудах закипит и вытолкнет из них пробки.

Для контроля за работой автоклавов среди стерилизуемых предметов можно закладывать специальные тесты-ампулы, содержащие химические вещества, которые плавятся при определенной температуре. Так, температура плавления бензонафтола 110 °С, антипирина — 113 °С. Автоклав используют и для дробной стерилизации текучим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы обеспечить свободный выход пару.

Рис. 8. Схема автоклава: 1 — воронка, через которую автоклав заправляют водой; 2 — предохранительный клапан; 3 — манометр; 4 — крышка автоклава; 5 — водопаровая камера; 6 — кран для выпуска воздуха; 7 — отверстие, через которое пар поступает в стерилизационную камеру; 8 — стерилизационная камера; 9 — подставка для размещения стерилизуемых материалов

 

4.2.5. Пастеризация

 

Пастеризация представляет собой неполную, или частичную, стерилизацию, что означает нагревание при 65 — 80 °С в течение соответственно 30 — 10 мин с последующим быстрым охлаждением до 10 — 11 °С. Прием был предложен Л. Пастером для уничтожения неспорообразующих бактерий в продуктах, чьи свойства ухудшаются при кипячении (молоко, пиво, вино и др.). Так как при пастеризации споровые формы выживают, то для того чтобы споры не проросли, пастеризованные продукты хранятся на холоду.

Тиндализация - дробная пастеризация, которая осуществляется несколько раз (6 - 7 дней) с промежутками в 24 ч, когда стерилизуемый материал выдерживают при 18 — 20° С для прорастания спор в вегетативные клетки, которые уничтожаются при последующей пастеризации.

Стерилизация  лучистой энергией. Действие ультрафиолетовых лучей находит широкое использование для стерилизации воздуха в лабораторных помещениях, в цехах промышленных предприятий. Для обеззараживания воздуха используют бактерицидные лампы. Ввиду возможного неблагоприятного действия ультрафиолетовых лучей на организм человека бактерицидные лампы включают только при отсутствии людей в помещении.

 

4.2.6. Холодная  стерилизация (механический метод)  — фильтрование через мелкопористые фильтры

 

Применяют для обработки  сред, компоненты которых легко разлагаются  при нагревании. Через мелкие поры фильтра могут пройти только ультрамикроорганизмы (вирусы, бактериофаги).

Наиболее часто используют фильтры из каолина (полые цилиндры, закрытые с одной стороны). Чтобы жидкость прошла через такой фильтр, необходимо создать разницу давлений по обе стороны цилиндра. Этого достигают нагнетанием или откачиванием воздуха при помощи масляных насосов. Фильтр соединяют с приемником для жидкой среды, которым служит колба Бунзена. Оттянутый конец колбы закрывают ватной пробкой. Смонтированные фильтр с приемником стерилизуют.

Среду для стерилизации наливают в сосуд, в который помещают фильтр, а колбу Бунзена с ватной пробкой соединяют с насосом (масляным или водоструйным) и выкачивают воздух. Поскольку внутри фильтра давление стало ниже, чем над его поверхностью, жидкость под давлением проходит через фильтр в приемник. Бактерии остаются с внешней стороны фильтра.

Неудобства этого метода заключаются в медленной фильтрации и необходимости частой очистки фильтров.

 

4.2.7. Химический  метод стерилизации

 

Применяется при дезинфекции. Дезинфекция - это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильнодействующих химических веществ или так называемых антисептиков. Гибель микроорганизмов при дезинфекции происходит в основном в результате гидролиза компонентов клетки, коагуляции белков, инактивации клеточных ферментов.

К группе антисептиков относятся  неорганические и органические вещества. Из неорганических антисептиков широко используются неорганические кислоты, щелочи и соли (0,1 - 0,2% растворы сулемы), хлорная известь 10-20%, йод; из органических веществ - этиловый и бутиловый спирты, альдегиды, органические кислоты и растворители (3-5% раствор фенола, 0,2 — 0,5% раствор хлорамина и 1 — 4% раствор формалина). В лабораторной практике методы дезинфекции применяют для обезвреживания рабочего стола, рук, камер для посевов.

 

4.2.8. Подготовка  посуды и сред к стерилизации

 

Посуду перед стерилизацией  тщательно моют, сушат и завертывают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания.

Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бумаги, шириной 4-5 см. В концы пипеток, которые берут в рот, предварительно вставляют ватные тампоны. Обмотку начинают с противоположного конца постепенным движением бумаги по спирали и оканчивают у конца с тампоном. Бумага должна плотно охватывать пипетку. Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов заворачивают по несколько штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы.

Шпатели обертывают по отдельности  аналогично пипеткам, используя для обмотки полоски бумаги большей ширины.

Чашки Петри завертывают  вместе по 2 - 4 штуки.

Колбы, пробирки и др. сосуды закрывают ватными пробками, а сверху бумажными салфетками.

 

4.3. Техника  посева и пересева культур  микроорганизмов

 

В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на твердых и жидких средах в пробирках, колбах или в чашках Петри.

Посевом в микробиологии называют внесение клеток микроорганизмов (посевного материала - инокулята) в стерильные среды.

Пересев - это перенос выращенной культуры микроорганизмов на питательной среде на другую свежую питательную среду.

Посев (и пересев) микроорганизмов  проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.

 

4.3.1. Пересев  микроорганизмов, выращенных на твердой среде в пробирках, в другие пробирки со средой

 

- На пробирке со  свежей питательной средой разборчиво подписывают название микроорганизма и дату посева. Надписи делают чернилами по стеклу или стеклографом.

- Зажигают горелку.  Посевы проводят над пламенем горелки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал.