Культивирование микроорганизмов

Количество КОЕ в 1 г сырой почвы устанавливают, умножая число колоний в чашке на степень разведения — число, показывающее, во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы. Казалось бы, во всех вариантах посева должно получиться примерно одинаковое число КОЕ, однако на практике происходит не так.

Иногда клеток так  много, что развившиеся колонии  микроорганизмов сливаются, что  часто наблюдается в чашках при разведении 10~². При высоких разведениях вырастают единичные колонии (меньше 10 на чашке), которые могут образоваться от случайно попавших клеток из воздуха при внесении в чашку почвенной суспензии или питательной среды. Учет таких чашек сделает подсчет недостоверным. Для правильного определения численности КОЕ подсчитывают только чашки, в которых колоний свыше 10 и не более 250—300 (в последнем случае при условии, если колонии очень мелкие).

При подсчете колоний  чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учитывать одни и те же колонии, подсчитанные отмечают чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Можно использовать и специальный прибор для подсчета колоний.

Бывают случаи, когда  в последнем разведении (10~⁶) число колоний значительно больше 300. Такой посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет выполняют, учитывая, что он дает представление лишь о минимальной численности микроорганизмов в почве.

Метод питательных пластин легко выполним, но имеет ряд недостатков, самый существенный из которых — отсутствие универсальной среды для развития всех микроорганизмов, обитающих в почве. Питание у разных бактерий специфично, и на каждой среде выявляется довольно узкая физиологическая группа. Так, на МПА развиваются в основном гнилостные бактерии, способные усваивать легко доступные органические формы азота. Нитрифицирующие, целлюлозоразрушающие, азотфиксирующие и другие бактерии на этой среде не развиваются. Для более полного представления о населенности почвы делают посевы на элективные среды или используют метод прямого подсчета микроорганизмов под микроскопом.

Второй недостаток метода питательных пластин — вероятность неполного учета клеток в образце в связи с тем, что в одном месте в агаре может застыть не одна, а несколько клеток. Образованные ими колонии сливаются, создавая впечатление одной колонии. Если такие колонии имеют неоднородную структуру, можно внести поправку при подсчете, приготовив из них окрашенный препарат. Если под микроскопом обнаруживаются разные формы клеток, например кокки, палочки и сарцины, то считают, что это не одна колония, а, как в данном примере, три. Если все формы клеток одинаковые, то расценивают колонию как результат развития одной клетки (хотя в этом месте одинаковых клеток могло быть 5, 10 и более).

Для сравнения количества КОЕ в разных почвах необходимо подсчитать их число в 1 г абсолютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взятием навески почвы для приготовления разведений в отдельный бюкс (металлический или стеклянный), высушенный до постоянной массы, берут навеску (5—10 г) для определения влажности почвы. Сушат почву при 105 °С до постоянной массы. Для определения числа КОЕ в 1 г сырой почвы определяют разность между массами сырой и сухой почвы, делят ее на массу навески и умножают на 100. Затем число клеток в 1 г сырой почвы надо разделить на количество абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Пример расчета.

В 1г сырой почвы  содержится 5600 клеток. При влажности почвы 30% это число клеток будет соответствовать 0,7 г абсолютно сухой почвы. Определяем численность клеток в 1 г абсолютно сухой почвы:

0,7 г абсолютно сухой  почвы содержат 5600 клеток 

1,0 г                       »                     »          х

х= 5600/0,7 = 8000 (клеток). Таким  образом, в 1 г абсолютно сухой почвы содержится 8 тыс. живых клеток.

 

4.6.1.2. Учет численности  КОЕ в воде и других жидкостях

 

Число микроорганизмов  в воде, навозной жиже, огуречном рассоле и других жидких субстратах можно определять различными методами. Если исследование ведут, пользуясь методом питательных пластин, то сначала воду и другие исследуемые жидкости 3 мин хорошо взбалтывают. Затем берут стерильной пипеткой 1 мл жидкости и вносят ее в 99 мл стерильной водопроводной воды. Это — исходное разбавление субстрата в 100 раз. Другой стерильной пипеткой набирают 10 мл исходного разведения и вносят в 90 мл воды, взбалтывают 5 мин и далее готовят методом разведения разные концентрации исследуемой жидкости и определяют число КОЕ в 1 мл.

 

4.6.1.3. Учет численности  КОЕ в воздухе

 

При определении числа  микроорганизмов в воздухе его  определенный объем пропускают через пробирку с 10 мл стерильной водопроводной воды. Для этого ее закрывают стерильной пробкой с двумя стеклянными трубками. Одну трубку, сообщающуюся с воздухом, опускают в воду до дна пробирки, а отверстие другой, соединенной с аспиратором, находится сразу под пробкой. По количеству воды (в литрах), выпущенной из аспиратора, устанавливают объем воздуха, прошедшего через стерильную воду в пробирке.

При прохождении воздуха  через воду микроорганизмы остаются в воде, и их численность затем  определяют после приготовления  соответствующих разведений методом  питательных пластин, как было описано выше. Зная объем воздуха, прошедшего через воду, делают пересчет на 1 м³ воздуха.

Для определения количества КОЕ в воздухе можно использовать и более простой, но менее точный метод Коха (осаждение клеток микроорганизмов на плотных питательных средах). Суть его сводится к следующему. Стерильные чашки Петри с питательной средой (МПА, МПЖ или кусок вареной картофелины) открывают в исследуемом помещении (или на исследуемой площади) на 5 мин. Частицы пыли с бактериями под действием силы тяжести оседают на поверхность плотной питательной среды. Через 48 ч инкубации при 28—30 °С осевшие бактерии образуют на среде колонии, которые можно подсчитать (см. 5.1.1). Поскольку некоторые микроорганизмы развиваются медленно, окончательно подсчитывают колонии на 5-е сут.

На площади в 100 см² за 5 мин осаждается примерно столько клеток, сколько их находится в 10 л воздуха (0,01 м³). Зная площадь чашки Петри, можно подсчитать количество клеток в 1 м³ воздуха. Для этого число колоний, выросших в чашке Петри, относят к общей площади чашки, затем пересчитывают, сколько таких колоний поместилось бы на 100 см² и далее — в 1 м³ воздуха.

Пример расчета. В чашке Петри диаметром   10см  выросло 45 колоний.  Площадь чашки  (Пг²) составит 3,14 • 5² = 78,5  (см²).

Далее подсчитывают число  клеток на 100 см² (равнозначных 10 л, или 0,01 м³ воздуха):

78,5 см² воздуха содержат 45 клеток

100,0 см²  »   » х

х=100х45/78,5=57

Таким образом, в 0,01 м³ воздуха находится 57 клеток, а в 1 м³ их будет в 100 раз больше — 5700.

В исследуемых помещениях чашки Петри с агаром лучше  размещать по 2—3. После подсчета колоний в каждой чашке выводят их среднее арифметическое значение.

 

Вопросы для  самостоятельной работы

 

1. Что такое физиология  микроорганизмов?

2. Каков химический  состав микроорганизмов?

3. Что такое ферменты  и какова их роль в жизнедеятельности микроорганизмов? Классификация ферментов.

4. На какие группы  подразделяют микроорганизмы по  способу питания и дыхания? 

5. Какова классификация  питательных сред?

6. Где используют ароматообразующие  бактерии?

7. Какие методы учета  численности микроорганизмов Вам известны?

8. Какие признаки отмечают  при описании колоний микроорганизмов?

9. Перечислите методы  выделения чистых культур?

10. Какие методы стерилизации  Вам извест