Определение каталазной и пероксидазной активности в тканях высшего водного растения

 СОДЕРЖАНИЕ

                                                                                                                           Стр.

Введение……………………………………………………………………	3
1. Обзор литературы………………………………………………………..	6
1.1. Система антиоксидантной защиты растений………………………..	6
1.1.1. Строение, функции и локализация каталазы в тканях растений…	7
1.1.2. Особенности строения пероксидазы……………………………….	9
1.2. Влияние тяжёлых металлов на растительные организмы…...……...	18
1.3. Влияние синтетических поверхностно-активных веществ на растительные организмы ………………………………………………….	22
1.4. Влияние температуры на растительные организмы.………………	24
1.5. Общие понятия  о стрессе, стрессоре…………………………………	25
1.6. Роголистник погружённый..………………………………………….	31
2. Экспериментальная часть……………………………………………….	34
2.1. Материалы  и методика исследований……………………………….	34
2.1.1. Объект исследований……………………………………………….	34
2.1.2. Схема проведения  эксперимента…………………………………...	34
2.1.3. Колориметрический метод определения активности пероксидазы (по А.М. Бояркину)…………………………………………………………	35
2.1.4.  Метод определения активности каталазы (Королюк М. А.)……..	36
2.1.5. Экстракция  водорастворимых белков……………………………...	37
2.1.6 Определение  количественного содержания белков……………….	37
2.2. Статистическая обработка полученных результатов……………….	38
2.3. Результаты  исследований и их обсуждения…………………………	38
Выводы…………………………………………………………………….	52
Список использованных источников……………………………………..	54
Приложение…………………………………………………………………	60

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Актуальность. В связи с увеличивающимся антропогенным воздействием загрязнение природной среды тяжелыми металлами (ТМ), в число которых входят ртуть, свинец, кадмий, медь, цинк и некоторые другие, становится одной из острых экологических проблем современности. Попадая различными путями в окружающую среду, ТМ поступают сначала в растения, а затем – в организмы животных и человека. Среди неорганических загрязнителей ТМ являются наиболее токсичными и представляют серьезную угрозу для многих форм жизни.

В последние два десятилетия  значительно возрос интерес к  экологическим аспектам загрязнения  водных объектов синтетическими поверхностно-активными  веществами (СПАВ), получаемыми из углеводородов  нефти. Это обусловлено, с одной  стороны, возрастающими масштабами производства и объемами использования этих соединений в различных отраслях промышленности (в том числе в производстве синтетических моющих средств, или СМС), в быту и сельском хозяйстве, а с другой – чрезвычайной широким диапазоном отрицательного влияния СПАВ как на водные экосистемы, так и на организм человека, а также их устойчивостью к биодеградации. При этом наиболее опасными для живых организмов являются катионные СПАВ.

Активные формы кислорода (АФК), образующиеся при поступлении  поллютантов в организм, способны повреждать нативную структуру клеточных мембран и инициировать процессы перекисного окисления липидов, что может привести к развитию окислительного стресса. Вместе с тем, в клетках существуют антиоксидантные системы, включающие ферменты (каталазу, пероксидазу, супероксиддисмутазу и др.) и низкомолекулярные соединения, которые обеспечивают защиту живых организмов от АФК.

К настоящему времени ответные реакции высших водных растений, являющихся важным объектом биотестирования и  биоиндикации природных вод, на воздействие ксенобиотиков остаются малоизученными. Кроме того, практически отсутствуют сведения о возможности выведения поллютантов из организмов высших водных растений.

Температура воды является одним из важных физических факторов для высших водных растений. Повреждающее действие во многом определяется не только абсолютным значением, но и продолжительностью действия высоких температур. С температурой воды тесно связана растворимость химических веществ, а следовательно, и величина их концентраций. Чем выше температура воды, тем выше растворимость большинства ядов (например, солей тяжелых металлов) и их концентрация в воде.

Практическое значение – работа представляет определенный интерес для специалистов в области охраны окружающей среды.

Научная новизна исследования состоит в получении данных о состоянии растения после периода реабилитации и изучении сочетанного действия факторов.

Целью нашей работы явилось  исследование динамики пероксидазной  и каталазной активности в тканях водного растения Ceratophyllum demersum L. при воздействии ионов ТМ, катионных СПАВ, повышенной температуры воды 36 °С и их сочетания, а также в период реабилитации, после удаления поллютантов из воды и снижения температуры до физиологической нормы.

Задачи исследования:

1. Определение пероксидазной и каталазной активности в тканях водного растения Ceratophyllum demersum L. при воздействии ионов свинца.

2. Определение пероксидазной и каталазной активности в тканях водного растения Ceratophyllum demersum L. при воздействии катионных СПАВ.

3. Определение пероксидазной и каталазной активности в тканях водного растения Ceratophyllum demersum L. при воздействии повышенной температуры.

         4. Определение пероксидазной и каталазной активности в тканях водного растения Ceratophyllum demersum L. при сочетанном воздействии факторов.

Настоящая работа выполнялась на кафедре биохимии ФГБОУ ВПО «Самарский государственный  университет».

В 2012-2013 гг. по результатам  наших исследований было опубликовано 3 статьи  в материалах Международных конференций.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.1. Система антиоксидантной защиты растений

 

В результате воздействия  практически всех неблагоприятных  факторов внешней среды, возникает  окислительный стресс. Образующиеся активные формы кислорода (АФК), обладают чрезвычайно высокой реакционной способностью. Так, они способны окислять практически все классы биологических молекул – белки, липиды мембран, молекулы ДНК и т.д. [62].

К АФК относят  синглетный кислород (1О₂), супероксид анион радикал (О₂^•-), гидропероксидный радикал (НО₂^•), пероксид водорода (H₂О₂), гидроксильный радикал (HО•), в некоторых случаях озон (О₃) [52].

Активные формы  кислорода высоко-токсичны, они непрерывно находятся под контролем организма [9, 10].

Поддержание концентрации уже  образовавшихся в клетке АФК на достаточно низком уровне и локализацию их действия осуществляет специализированная многокомпонентная антиокислительная система АОС (антиоксидантная система), от состояния которой во многом зависит устойчивость растений к стрессовым воздействиям. 

Важнейшими высокомолекулярными  антиоксидантами растений, непосредственно  обезвреживающими АФК, выступают специализированные ферментные системы (каталаза, пероксидаза  и т.д.) способные тормозить или  устранять свободнорадикальное  окисление органических веществ.

Ферменты-антиоксиданты, обеспечивающие комплексную защиту биополимеров от АФК, расположены в различных  клеточных компартментах,  имеют  разную субстратную специфичность  и сродство с активными формами кислорода [51]. 

 

 

 

1. Строение, функции и локализация каталазы в тканях растений

 

Каталаза ˗˗ компонент ферментативной защиты клетки от токсичных соединений кислорода. Широко распространена в растениях [45]. 

Каталаза (КФ 1.11.1.6) – оксидоредуктаза с молекулярной массой около 250 кД. Это двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и соединенной с ним простетической группы, последняя содержит гематин. Простетическая группа каталазы связана с белком двумя карбоксилами. Ингибируется каталаза синильной кислотой, сероводородом, фторидами [31]. На рисунке 1.1 представлена трехмерная модель каталазы.

 

Рис. 1.1.  Трехмерная  модель каталазы [31].

          

 Сущность каталитического действия каталазы состоит в разложении перекиси водорода с выделением молекулярного кислорода. В процессе взаимодействия каталазы с пероксидом образуется неустойчивое промежуточное соединение зеленого цвета. Именно оно и служит тем важным звеном, которое определяет весь ход каталитического разложения пероксида [47].

Реакция с участием данного фермента требует двух молекул пероксида водорода, одна молекула действует как донор, другая как акцептор. Соответственно реакция протекает в два этапа:

FeOH + H₂O₂ → Fe + H₂O

FeOOH + H₂O₂ → FeOH + H₂O + O₂

При больших  концентрациях пероксида (по Чансу) каталаза образует с пероксидом два соединения – одно из них, красного цвета, слабоактивно, а другое вовсе не обладает каталитической активностью [47].

Промежуточное зеленое соединение реагирует со второй молекулой пероксида по схеме (рис.1.2):

 
Рис. 1.2.   Каталитическое разложение пероксида [31].

 

 Таким образом, благодаря ферменту осуществляется снабжение молекулярным кислородом участков ткани, куда доступ его затруднен. Известно, что активность фермента зависит от вида растения, возраста клеток, типа ткани и других факторов [31].

Полагают, что  каталаза не имеет высокого сродства к перекиси водорода и не может  эффективно обезвредить это соединение при низких концентрациях, в  отличие от пероксидаз, которые функционируют только при относительно низком уровне пероксида. Так как каталаза относится к числу ферментов с наиболее высоким числом оборотов и она способна расщепить 44 000 молекул H₂O₂ в секунду [44].

В живой клетке основными  поставщиками пероксида водорода являются флавопротеидные ферменты, которые  сами по себе не способны разлагать перекись [42].

Каталаза, играет определенную роль в процессах адаптации  организма к стресс-факторам. Есть предположения, что каталаза принимает участие в процессах сопряженного окислительного фосфорилирования, осуществляемого митохондриями. Одновременно это свидетельствует о функциональной взаимосвязи катализаторов, локализованных в разных структурных компонентах клетки [35].

Снижать активность каталазы могут различные вещества: цианиды, азиды, сульфиды, нитраты, фосфаты, сульфаты, многие другие кислоты. Снижение активности каталазы также наблюдается при избытке метионина, тирозина, цистина, меди, цинка.

При этом в окисленном состоянии  каталаза работает как пероксидаза. Субстратами в пероксидазной  реакции могут быть этанол, метанол, формиат, формальдегид и другие доноры водорода [22, 35].

Каталаза локализована преимущественно  в пероксисомах и глиокисомах, специфическая  изоформа обнаружена также в митохондриях, активность ее обнаружена и в хлоропластах растений [54].

 

• 1.1.2. Особенности строения пероксидазы

 

Пероксидаза (КФ 1.11.1.7) – двухкомпонентный фермент класса оксидоредуктаз, состоящий из гематина С₃₄Н₃₂О₄N₄Fе(III)ОН (низкомолекулярного кофермента, содержащего железо) и апофермента (белковой частицы, составляющей основную часть фермента) [23, 31].

Очищенная кристаллическая  растительная пероксидаза имеет молекулярную массу 44 000 Да [54].  Гематин составляет 1,48% этой массы. По аминокислотному составу белок пероксидазы имеет некоторые особенности: в нем отсутствуют триптофан и оксипролин, к тому же он неоднороден [5] .

Фермент имеет размер белковой глобулы равной 50Ǻ, содержащий около 43% α-спиралбных участков.

Гемин нековалентно закреплён  в углублении полипептидной цепи между доменами, и удерживается там  за счёт гидрофобных связей и солевого мостика, образованного между остатком пропионовой кислоты гемина с одной из аминогрупп апобелка. Гемин можно обратимо отделить от белка при кислых pH [58].

По номенклатуре ферментов, принятой на Международном  биохимическом съезде в 1979 г., пероксидаза – фермент,  действующий на перекись водорода в качестве акцептора.

Изученные до настоящего времени пероксидазы состоят  из неокрашенного гликопротеина  и соединённого с ним коричнево  – красного феррипорфирина. Геминовая часть молекулы (гемин) – железопротопорфирин IX представлен на рис. 1.3.

Выполняя роль активного центра, он участвует в  разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают  радикалы соответствующих субстратов. Простетическая группа пероксидаз хрена  и японской редиски, цитохрома с, хлоропероксидазы известна как феррипротопорфирин IX. Полагают, что все известные пероксидазы и их изоформы содержат этот гемин [79].