Определение каталазной и пероксидазной активности в тканях высшего водного растения

6. Повышение содержания  аминокислоты пролина, которая может образовывать агрегаты, ведущие себя как гидрофильные коллоиды и способствующие удержанию воды в клетке. Пролин может связываться с белковыми молекулами, защищая их от денатурации.

7. Активация синтеза стрессовых  белков.

8. Усиление активности протонной помпы в плазмалемме и, возможно, в тонопласте, препятствующей неблагоприятным сдвигам ионного гомеостаза.

9. Усиление синтеза этилена  и абсцизовой кислоты, торможение  деления и роста, поглотительной  активности клеток и других физиологических процессов, осуществляющихся в обычных условиях.

Перечисленные стрессовые реакции  наблюдаются при действии любых  стрессоров. Они направлены на защиту внутриклеточных структур и устранение неблагоприятных изменений в клетках. Все эти явления адапционного синдрома (стресса) взаимосвязаны и развиваются как каскадные саморазвивающиеся процессы [51].

Вторая фаза –  фаза адаптации. В ходе второй фазы у растений на основании изменений, произошедших во время первой фазы, включаются главные механизмы адаптации. На этой стадии инициируются защитные реакции, также в значительной степени неспецифичные, способствующие более интенсивному синтезу белка и нуклеиновых кислот. За счет образования стрессовых белков-изоферментов усиливается «мощность» ферментных систем; происходит стабилизация мембран, в результате чего восстанавливается ионный транспорт; повышаются активность функционирования митохондрий, хлоропластов и соответственно уровень энергообеспечения; снижается генерация активных форм кислорода и тормозится ПОЛ; возрастает роль компенсаторных шунтовых механизмов (усиливается активность пентозофосфатного пути дыхания как поставщика восстановителя и пентоз, необходимых для синтезов (в частности, нуклеиновых кислот) [9].

Адаптация (лат. adaptio – приспособление, прилаживание) – это генетически детерминированный процесс формирования защитных систем, обеспечивающих повышение устойчивости и протекание онтогенеза в ранее неблагоприятных для него условиях. Адаптация включает в себя все процессы (анатомические, морфологические, физиологические, поведенческие, популяционные и др.) от самой незначительной реакции организма на изменение внешних или внутренних условий, которая способствует повышению устойчивости, до выживания конкретного вида [25].

Выбор растением стратегии (способа) адаптации зависит от многих факторов.

При внезапном действии экстремального фактора ответ должен последовать  незамедлительно. В соответствии с  этим различают три главные стратегии  адаптации: эволюционные, онтогенетические и срочные.

Эволюционные (филогенетические) адаптации – это адаптации, возникающие в ходе эволюционного процесса (филогенеза) на основе генетических мутаций, отбора и передающиеся по наследству.

Онтогенетические, или фенотипические, адаптации обеспечивают выживание данного индивида. Они связаны с генетическими мутациями и не передаются по наследству. Формирование такого рода приспособлений требует сравнительно много времени, поэтому их иногда называют долговременными адаптациями.

Срочная адаптация, в основе которой лежит образование  и функционирование шоковых защитных систем, происходит при быстрых и интенсивных изменениях условий обитания. Эти системы обеспечивают лишь кратковременное выживание при повреждающем действии фактора и тем самым создают условия для формирования более надежных долговременных механизмов адаптации.

Существует  бесконечное множество путей адаптации растений. Тем не менее, все адаптации условно можно разделить лишь на два принципиально различных типа: активная и пассивная адаптация.

Активная адаптация  – формирование защитных механизмов, при этом обязательным условием выживания является индукция синтеза ферментов с новыми свойствами или новых белков, обеспечивающих защиту клетки и протекание метаболизма в ранее непригодных для жизни условиях.

Пассивная адаптация  – «уход» от повреждающего действия стрессора или сосуществование с ним. К пассивным адаптациям относятся, например, переход в состояние покоя, способность растений изолировать «агрессивные» соединения, такие как тяжелые металлы в стареющих органах, тканях или в вакуолях, т.е. сосуществовать с ними.

 Однако часто растения одновременно используют как активные, так и пассивные пути адаптации [3].

В процессе адаптации  растение проходит два различных  этапа:

1) быстрый первичный  ответ;

2) значительно  более длительный этап, связанный  с формированием новых изоэнзимов  или стрессорных белков, которые обеспечивают протекание метаболизма в изменившихся условиях.

Быстрая первичная  реакция растения на повреждающее воздействие  называется стресс-реакцией, а следующая за ней фаза – специализированной адаптацией. В случае прекращения действия стрессора растение переходит в состояние восстановления. Напротив, если стрессорное воздействие превышает защитные возможности организма, то развивается повреждение и наступает смерть.

Две фазы адаптации  выполняют различные биологические  функции. Стресс-реакция обеспечивает кратковременную защиту растения от гибели за счет формирования и функционирования быстрых защитных механизмов и предоставляет время для формирования более надежных и более эффективных механизмов специализированной устойчивости.

В отличие от стресс-реакции, для которой характерно наличие элементов повреждения  и функционирование аварийных защитных систем, для фазы специализированной адаптации свойственно образование  новых, более надежных и более  эффективных защитных механизмов, ответственных за протекание онтогенеза в условиях длительного действия стрессора. Такими механизмами могут быть, например, аккумуляция фитохелатинов в ответ на действие тяжелых металлов [25].

Третья  фаза – фаза истощения. На этой стадии, в условиях возрастания силы эффекта и постепенного исчерпания защитных возможностей организма, также доминируют неспецифические реакции. Для фазы истощения характерны разрушение клеточных структур: деструкция ядра, распад гран в хлоропластах, уменьшение количества крист в митохондриях; образование дополнительных вакуолей; сдвиги физико-химического состояния цитоплазмы.

Нарушение ультраструктуры  основных энергетических генераторов  – митохондрий и хлоропластов – приводит к энергетическому истощению клетки, что и влечет за собой сдвиги физико-химического состояния цитоплазмы. Эти сдвиги свидетельствуют о сильных, необратимых повреждениях клетки.

Фаза  регенерации (реституции). Некоторые исследователи предлагают дополнить триаду Селье еще одной фазой – четвертой, назвав ее фазой регенерации (реституции), наступление которой возможно после удаления стрессора. Данный этап не может быть повторением второй фазы, поскольку к этому времени организм оказывается слишком ослабленным [9].

 

1.6. Роголистник погружённый

 

Классификация:

Царство – Растения (Plantae)

Oтдел – Покрытосеменные (Magnoliophyta)

Kласс – Двудольные (Dicotyledones)

Порядок – Роголистникоцветные (Ceratophyllales)

Семейство –  Роголистниковые (Ceratophyllaceae)

Род – Роголистник (Ceratophyllum)

Вид – Роголистник  погружённый (Ceratophyllum L.)

 Роголистник погружённый (Ceratophyllum L.) распространён по всему земному шару в стоячих и медленно текущих водах [37]. Образует густые заросли [63].

Ареал: Азия, Европа, Южная Африка, Америка [57].

Роголистник погружённый  – многолетнее растение [39]. Может расти на большой глубине, до 9 метров.

Роголистник погружённый представляет собой длинный, тонкий и эластичный стебель, на котором расположены довольно жесткие листики-иголочки. Листья однажды-дважды вильчато-рассечённые, с одного края с частыми мелкими зубчиками [17, 23].

Стебель пускает  боковые побеги. Цвет листьев и  стебля этого растения соответствует  его названию – темно-зеленый. По всей длине стебля находятся, так  называемые, мутовки, т.е. места соединения листиков.

Цветки роголистника мелкие, едва заметные, без лепестков. Тычиночные и пестичные цветки расположены на одном растении.  Роголистник всю жизнь проводит в воде, даже опыляется под водой. Созревая, тычинки отделяются от цветка и всплывают на поверхность. Здесь-то пыльца и высыпается из пыльников. Будучи тяжелее воды, она опускается и попадает на рыльца пестиков [68]. Цветёт в июле – июне [48].

Плод – продолговато-овальный орешек с 3 колючками [23, 56]. Плодоношение крайне нерегулярное [71].

Роголистник плавает, в основном, в толще и на поверхности воды. Он полностью лишён корней и проводящих тканей, а элементы минерального питания получает непосредственно из окружающей его воды через всю поверхность тела [26].

Роголистник погружённый вырастает до 150 см в длину.

Роголистник погружённый – растение многолетнее, отмирающее зимой. Осенью, при понижении температуры воды до 12-14°С большая часть растения отмирает, а верхушки побегов с почками опускаются на дно водоема, где и зимуют.

Весной роголистник  возобновляет свою жизнедеятельность и начинает бурно разрастаться. Но, при ярком освещении и теплой воде роголистник темно-зеленый сохраняет свой внешний вид и растет в аквариумах круглый год [68].

Используется  для предотвращения загрязнения  воды в декоративном водоеме. Роголистник иногда содержат в аквариумах. Он служит кормом некоторым рыбам и улиткам. Роголистники не только образуют красивые заросли но и улучшают качество воды, очищая ее и насыщая кислородом, в чём легко убедиться, положив несколько веток растения в сосуд  с мутной водой: через несколько часов вода станет чистой и прозрачной, а листья растения покроются грязью [24].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ  ЧАСТЬ

 

2.1. Материалы  и методика исследований

 

2.1.1. Объект исследований

 

Объектом исследования был выбран пресноводный макрофит роголистник погруженный (Ceratophyllum demersum L.), принадлежащий к семейству роголистниковых (Ceratophyllaceae), порядку роголистникоцветных (Ceratophyllales), подклассу магнолиид (Magnoliidae), классу двудольных (Dicotyledones) [63].

Эксперимент проводился в лабораторных условиях при одинаковой интенсивности и регулярности светового потока, а также при постоянной температуре (20°С). Для этого в опыте была использована комбинация люминесцентных ламп и установлен постоянный период освещения, равный 18 ч.

 

2.1.2. Схема проведения  эксперимента

 

В ходе нашего эксперимента растения были разделены на 8 групп, различающиеся средой выращивания. Контрольная группа растений находилась в среде отфильтрованной водопроводной воды, семь опытных инкубировались в присутствии Pb(CH₃COO)₂ в концентрации 100 мкМ/л, катионных СПАВ в концентрации 1 %, повышенной t 36°С и их сочетании в указанных концентрациях. Непосредственно перед началом исследований фрагменты растений длиной до 50 мм, считая от точки роста, помещали в стеклянные емкости объемом 1 дм³.

 Продолжительность  воздействия выбранного нами фактора составила 3 суток. По истечении указанного периода экспозиции часть растений из каждой группы отбирали на исследования, а часть переносили в чистую отфильтрованную воду для реабилитации (длительностью 5 суток). После реабилитации также проводили измерения каталазной и пероксидазной активности.

 

 2.1.3. Метод определения активности пероксидазы [27].

 

 Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования синего продукта окисления определённой концентрации, за0ранее устанавливаемой на фотоэлектроколориметре.

Навеску растительного  материала массой 200-500 мг тонко растирали в фарфоровой ступке с водой, переносили в мерную колбу на 50 см³ и доводили до метки водой.

После 10 минут  настаивания вытяжку центрифугировали при 4000 об/мин. в течении 5 минут. Для измерения активности лучше брать такое разведение вытяжки, чтобы изменение окраски происходило за 20-60 с.

В 2 кварцевые  кюветы фотоэлектроколориметра с рабочей длиной 20 мм приливали по 2 см³ ферментной вытяжки или центрифугата, 2 см³ буферного раствора (0,2 н. ацетатный буфер с pH 5,4) и 2 см³ бензидина. Кюветы устанавливали против светофильтров. Измеряют оптическую плотность на фотометре КФК-3 при длине волны, равной 590 нм. Вначале устанавливают нулевую точку по контрольной кювете, в которую вносили, помимо вышеперечисленных компонентов реакционной смеси, 2 см³ воды. После этого в опытную (измерительную) кювету приливают 2 см³ 0,3%-ной перекиси водорода из пипетки с широким отверстием. С внесением первой капли перекиси водорода включают секундомер. Секундомер останавливают, когда показание оптической плотности доходит до пика. 

Пероксидазную активность вычисляли по найденной скорости реакции и выражали в удельных единицах на 1 г белка по формуле:

A=D (а·б·в)/(c·t), где D – оптическая плотность, равная 0,125; а – отношение количества жидкости, взятой для приготовления вытяжки, к массе водорастворимых белков в пробе, см³/г; б – степень дополнительного разведения вытяжки после центрифугирования; в – степень постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси в кювете; c – толщина слоя (2 см); t – время, с.                        

 

2.1.4. Метод определения активности каталазы [27].

 

Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Реакция запускается добавлением 0,1 мл растительного гомогената к 2 мл 0,03% раствора перекиси водорода. В качестве контрольной пробы используют 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через 10 мин добавлением 4% молибдата аммония. Затем измеряют интенсивность окраски на фотоколориметре «КФК — 2» при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода внесено 2 мл воды.         Активность каталазы рассчитывают по формуле: