Определение каталазной и пероксидазной активности в тканях высшего водного растения

А = (60*(Е_к – Е_н)*V₁*p) / (V₂ * t *b * k),

где А – удельная активность препарата каталазы, мМ/мл*ч,

Е_к – оптическая плотность холостой пробы,

Е_н – оптическая плотность опытной пробы,

V₁ – объём икубационной смеси, 2,1мл,

Р – разведение, 200,

V₂ – объём исследуемой жидкости, 0,1 мл,

t – время, 10 минут,

b – толщина кюветы, 0,5 см,

k – молярный коэффициент экстинкции, 22,2*10³ мМ^-1 см ^-1 .

 

 

 

 

2.1.5. Экстракция  водорастворимых белков [27].

 

Для выделения препарата белка использовали пробы, предварительно взвешенные на аналитических весах.

Навеску растительного  материала массой 300-400 мг тщательно  растирали  в фарфоровой ступке с 2 мл дистиллированной воды, после чего разбавляли полученную массу до 5 мл. Экстракт центрифугировали при 8000 об/мин в течении 15 мин. Супернатант  впоследствии аккуратно (чтобы не поднять осадок) переносился в пробирки и доводился до 10 мл для дальнейшего анализа.

 

2.1.6. Определение  количественного содержания белков [27].

 

Настоящий метод был разработан Мэрион Брэдфорд и был основан на связывании с белком одного из кислых красителей кумасси синего (Coomassi brilliant blue), выпускаемого в двух модификациях R-250 и G-250. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется. Этот краситель даёт лучшую чувствительность и линейную зависимость интенсивности окраски от концентрации белка в более широком её диапазоне.

Для приготовления 1 л раствора красителя брали навеску 100 мг Coomassi brilliant blue G-250 и растворяли в 50 мл 95%-ного этилового спирта с использованием магнитной мешалки. Полученный раствор вливали в 100 мл концентрированной ортофосфорной кислоты и доводили до 1 л дистиллированной водой. Спустя 24 часа, полученный раствор красителя профильтровывали с использованием обеззоленного бумажного фильтра медленной фильтрации. Раствор красителя хранится при комнатной температуре около двух недель.

Для количественного  определения водорастворимых белков брали 1 мл анализируемого раствора белка, смешивали с 5мл раствора красителя. Через 3-5 мин., но не позднее 1 часа измеряли оптическую плотность на фотометре КФК-3 при длине волны, равной λ 595 нм, используя в качестве контроля пробу, не содержащую белка.

Каждый раз  после измерения оптической плотности, кюветы промывали детергентом, водой и этиловым спиртом для удаления комплекса белка с красителем, образующим плёнку на стеклянной поверхности.

Определение количества белка в пробе проводили по построенным калибровочным графикам.

Стандартный раствор BSA, концентрацией 1000 мг/л, разводили в мерных колбах разбавлением для получения растворов следующих концентраций: 12,5, 25, 50 и 100 мкг/л. Приготовление калибровочных графиков и построение кривой проводили в 3-х повторах.

В соответствии с полученными по описанной выше методике оптическими плотностями окрашенных проб, строили график зависимости оптической плотности от количества белка в пробе. При приготовлении нового раствора красителя калибровку проводили заново [27].

 

2.2. Статистическая  обработка полученных результатов

 

Статистическую  обработку полученных результатов  осуществляли по общепринятой методике, с использованием критерия Стьюдента  – t ст. Осуществляли подсчёт достоверности отличий от контрольного значения.

 

2.3. Результаты  исследований и их обсуждение

 

Исследования по влиянию ионов свинца, катионных СПАВ, высокотемпературного стресса и их сочетания на растения C. demersum показали достоверно значимые отличия в уровне пероксидазной (ПО) и каталазной активности между опытными  и контрольными вариантами. На рисунке 2.1 представлена динамика ПО активности в период инкубации в среде ионов свинца и во время реабилитации.

Рис. 2.1. Динамика пероксидазной активности в период инкубации C. demersum в среде, содержащей ионы свинца и после реабилитации.

      * – степень достоверности р‹ 0,001

 

Нами было установлено  достоверное понижение ПО активности опытной группы растений в 3 раза, по сравнению с контрольными значениями, через 3 суток воздействия ионов свинца в концентрации 100 мкМ/л.

Похожий эффект воздействия ТМ на ПО активность был отмечен в обзоре авторов [74]. Из литературных данных известно, что двухвалентные катионы в высоких концентрациях способны частично или полностью вытеснять металлы из  активного центра ферментов, в результате чего теряется их активность [55, 78]. По-видимому, в нашем эксперименте происходило вытеснение кальция из молекул фермента ионами свинца, в результате чего ингибировалась ПО активность.

После реабилитации растений роголистника в чистой воде ПО активность в опытной группе еще  более значительно снизилась относительно контроля, а также по сравнению с пробами, исследованными на 3 сутки эксперимента, – 6 и 2 раза соответственно. Мы предположительно связываем такой эффект с затрудненностью выведения ионов свинца из двумембранных органелл (митохондрий и пластид), где сконцентрирован большой пул фермента ПО, и с продолжающимся повреждением фермента ПО либо ионами Pb²⁺ непосредственно, либо возрастающими концентрациями АФК.

        После 3-суточной инкубации растений в среде катионных СПАВ, ПО активность опытной группы возросла в 3 раза относительно контроля, а в постстрессовый период, напротив, происходило снижение величины данного показателя в 2 раза, по сравнению с контрольными значениями (рис. 2.2).

          

Рис. 2.2. Динамика пероксидазной активности в период инкубации C. demersum в среде, содержащей катионные поверхностно-активные вещества и во время реабилитации.

* – степень  достоверности р‹ 0,001

 

На наш взгляд, и такой эффект известен из литературы [81], это было обусловлено включением фермента ПО в реакции нейтрализации АФК (а именно, пероксида водорода) вследствие развития окислительного стресса.    Дальнейшее понижение уровня ПО активности в период реабилитации, по сравнению с 3 сутками эксперимента, по-видимому, было обусловлено солюбилизацией катионными СПАВ мембран митохондрий и пластид, где сосредоточен большой пул фермента ПО, с последующим проникновением ксенобиотика внутрь этих органелл и повреждением ими содержащихся здесь молекул фермента. В результате, фермент терял свои нативные свойства, что и приводило к ингибированию его активности.

Проанализировав данные рисунка  2.3 можно сказать, что после 3 суточного воздействия  сочетанного действия ионов свинца (C – 100мкМ) и катионных СПАВ (1%)  ПО активность в опытной группе растений, была достоверно выше контрольной группы в 3 раза.

После реабилитации растений роголистника в чистой воде ПО активность в опытной группе еще более значительно повысилась относительно контроля, а также по сравнению с пробами, исследованными на 3 сутки эксперимента, – 19 и 6 раз соответственно.

         Вероятная причина многократного  повышения пероксидазной активности  – активация синтеза фермента  в связи с потребностями клетки  в борьбе с окислительным стрессом.

Рис. 2.3. Динамика пероксидазной активности в период инкубации C. demersum в среде, содержащей ионы свинца и катионные поверхностно-активные вещества, а также во время реабилитации.

* – степень  достоверности р‹ 0,001

 

Высокотемпературный стресс снизил ферментативную активность на 11% .

После реабилитации ПО активность от высокотемпературного стресса – повысилась на 32 % в связи с потребностями в ликвидации АФК (рис. 2.4.).

Рис. 2.4. Динамика пероксидазной активности в период инкубации C. demersum при 36⁰С  и во время реабилитации.

 * – степень достоверности р‹ 0,05

** – степень  достоверности р‹ 0,001

 

Проанализировав полученные данные, можно сказать, что  после 3-суточного сочетанного действия стрессоров ˗˗ высокой температуры (36⁰С) и ионов свинца (100 мкМ)  ПО активность в опытной группе растений была ниже значений контрольной группы на 73 %.

 В период  реабилитации ПО ниже, относительно  контроля на 99%, а также ниже  по сравнению к третьим сутками  воздействия на 27%.

Вероятная причина  снижения ПО активности при сочетанном действии стрессоров – повреждение молекулы фермента ионами свинца, замещение ионов кальция в активном центре. Дальнейшее снижение уровня ПО активности в опытной группе растений, наблюдаемое в период реабилитации, мы предположительно связываем такой эффект с накоплением ионов свинца в митохондриях и пластидах, где, согласно литературным данным [11, 76], сконцентрирован большой пул фермента ПО. Поскольку выведение металла из органелл, окруженных двумя мембранами, было затруднено, то высокие концентрации свинца (100 мкМ), находящиеся внутри данных органелл, по-видимому, не позволяли растению восстанавливать ПО активность через 5 суток после перенесения в чистую воду, и с продолжающимся ингибированием фермента ПО либо ионами Pb²⁺ непосредственно, либо высокими концентрациями АФК.

Проанализировав данные рисунка  2.5 можно сказать, что после 3 суточного воздействия  сочетанного действия стрессоров –  высокой температуры (36⁰С) и катионных СПАВ (1%)  ПО активность в опытной группе растений, была достоверно выше контрольной группы на 20%.

Рис. 2.5 Динамика пероксидазной активности в период инкубации C. demersum при 36⁰С в присутствии катионных поверхностно-активных веществ и во время реабилитации.

              * – степень достоверности р‹ 0,01

 

В период реабилитации значения ПО активности вернулись к контрольным значения.

Токсический эффект СПАВ на ПО активность может проявляться  по-разному. В исследованиях Давлетшина А.И. с сотр. [38, 41] показано, что СПАВ способны как вызывать активацию фермента ПО, так и приводить к ингибированию его активности, воздействуя как на молекулы фермента непосредственно, так и на его мембранное окружение, либо на состояние субстрата. Дальнейшее понижение уровня ПО активности в период реабилитации, по сравнению с 3 сутками эксперимента, по-видимому, было обусловлено солюбилизацией катионными СПАВ мембран митохондрий и пластид [43], где сосредоточен большой пул фермента ПО, с последующим проникновением ксенобиотика внутрь этих органелл и повреждением им содержащихся здесь молекул фермента. В результате, фермент терял свои нативные свойства, что и приводило к ингибированию его активности.

Действие стрессовых факторов привело к снижению ПО активности опытной группы на 24 % относительно контроля.

В период реабилитации ПО ниже относительно контроля на 21%, а по сравнению с 3 сутками воздействия – практически не изменяется.

Вероятно ионы свинца и катионные СПАВ взаимодействуют, снижая негативный эффект друг друга  на C. demersum, температурный фактор способствует этому. Снижение ПО активности скорее всего связано с замещением ионов кальция в активном центре фермента и на ионы свинца.

 

Рис. 2.6. Динамика пероксидазной активности в период инкубации C. demersum при 36⁰С в присутствии ионов свинца, катионных поверхностно-активных веществ и во время реабилитации.

          * – степень достоверности р‹ 0,01

 

На рис. 2.7 представлена динамика каталазной активности.

Рис. 2.7. Динамика каталазной активности в период инкубации C. demersum в среде, содержащей ионы свинца и во время реабилитации.

   * – степень  достоверности р‹ 0,001

 

После трёх суток  инкубации в среде 100 мкМоль/л  ионов свинца ферментативная активность снизилась на 46%. Вероятной причиной снижения каталазной активности при действии тяжёлого металла может быть повреждение молекулы фермента ионами свинца.

После пяти суток  реабилитации от среды с ионами свинца каталазная активность восстановила своё значение до контрольных и даже превысила его на 44%, что вероятно, связано с повышенными потребностями клетки в утилизации продуктов АФК, вызванных ионами свинца.

Из данных, приведенных  на рис. 2.8 видно, что к концу 3 суток инкубации растений в среде катионных СПАВ каталазная активность в опытной группе превысила контрольные значения в 19 раз.

В период реабилитации каталазная активность снизилась и составила 72 % от контрольного значения.

         

Рис. 2.8. Динамика каталазной активности в период инкубации в среде, содержащей катионные поверхностно-активные вещества и во время реабилитации.

* – степень  достоверности р‹ 0,001

     

 Интересно отметить многократное повышение каталазной активности в период инкубации растений в среде 1% катионных СПАВ. ПАВ имеют свойство образовывать пленки на границе раздела фаз. Вероятно, в условиях данного эксперимента пленки катионных СПАВ на поверхности воды и клетки препятствовали нормальному дыханию растительного организма, поэтому многократное повышение каталазной активности следует рассматривать как компенсаторный механизм. Снижение ферментативной активности на пятые сутки реабилитации на 28% от контрольных значений могло быть обусловлено истощением пула каталазы.