Папилломавирусная инфекция

• чувствительность тестирования на ВПЧ (88-98%) превышает чувствительность цитологического исследования (51-86%);
• специфичность тестирования на ВПЧ (83-94%) уступает специфичности цитологического метода (92-99%);
• чувствительность и прогностическая значимость отрицательного теста на ВПЧ в сочетании с отрицательным результатом цитологического теста приближаются к 100%.

Важным аргументом сторонников использования теста на ВПЧ в первичном скрининге является также то, что высокая чувствительность и прогностическая значимость отрицательных результатов позволяют существенно увеличить интервал скрининга для женщин с отрицательным ВПЧ-тестом. Относительно невысокие показатели специфичности и прогностической значимости положительных результатов ВПЧ-теста обусловлены тем, что у большинства женщин, особенно молодых, ПВИ носит транзиторный характер. Однако среди женщин старше 30-35 лет показатели спонтанной элиминации вируса значительно ниже и, следовательно, выше диагностическая ценность теста на ВПЧ. На этом основании тестирование на ВПЧ в сочетании с цитологическим тестом официально одобрено в США для первичного скрининга среди женщин старше 30 лет. В случае отрицательных результатов обоих тестов рекомендуемый интервал скрининга составляет 3 года. Женщинам с отрицательным результатом цитологического исследования, но положительным тестом на ВПЧ онкогенных типов, рекомендуется повторить оба теста через 6-12 месяцев. Если при повторном обследовании результат какого-либо теста окажется положительным, показано проведение кольпоскопии. 

В Европе вопрос о применении теста на ВПЧ в первичном скрининге находится в стадии активного обсуждения. Более низкая по сравнению с цитологией специфичность теста на ВПЧ удерживает многие европейские агентства по изучению рака от включения его в скрининг, особенно в странах, где успешно действуют скрининговые  программы на основе цитологии. Для  повышения  специфичности тестирования  на  ВПЧ предлагается  несколько подходов. Один  из них состоит в использовании цитологического метода как дополнительного у ВПЧ-положительных женщин. Другой подход заключается в повторном тестировании на ВПЧ с интервалом в 6-12 месяцев. Динамическое наблюдение за ПВИ показало, что более чем в 80% случаев она носит транзиторный характер. Развитие тяжелой дисплазии возможно только у женщин с персистирующей ПВИ. Наиболее эффективным методом выявления персистенции вируса является генотипирование, так как тестирование на ВПЧ без определения типа не позволяет дифференцировать персистенцию от реинфекции.

В качестве одного из критериев клинически значимой инфекции, способной развиться в заболевание, рассматривается количество вируса (вирусная нагрузка). Было установлено, что показатель спонтанной элиминации вируса ниже, а риск прогрессии выше в случаях ПВИ с большой вирусной нагрузкой. Точную количественную оценку ДНК можно провести с применением метода полимеразно-цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Кроме того, мультиплексная ПЦР в реальном времени позволяет определить типы вируса в исследуемой пробе. Несмотря на то, что высокая вирусная нагрузка как фактор риска неопластической прогрессии активно изучается, использование ее в клинической практике в настоящее время представляется весьма проблематичным. Во-первых, зависимость степени дисплазии от вирусной нагрузки в достаточной мере описана только для ВПЧ 16-го типа, а во-вторых, вследствие отсутствия стандартизованной методологии определения количества вирусной ДНК нельзя установить пороговое значение, выше которого она может считаться клинической значимой.

Тестированию на ВПЧ отводится особая роль в первичном скрининге на цервикальные аденокарциномы — редкие, но особенно агрессивные неоплазии. Хотя этиологическая роль ВПЧ в развитии этого заболевания однозначно не определена, показано, что практически во всех цервикальных аденокарциномах обнаруживаются онкогенные типы ВПЧ, главным образом 18-го типа. Так как цитологические методы выявления атипичных клеток железистого эпителия имеют существенные ограничения, включение тестирования на ВПЧ в скрининговые программы может повысить показатель выявления цервикальных аденокарцином и предшествующих им поражений.

Определение  ВПЧ   может  играть  существенную  роль в скрининге на РШМ. Основные стратегии выявления ВПЧ при данном скрининге могут быть основаны на следующих положениях:  

1. Идентификация ВПЧ у женщин с нормальной цитологической картиной при исследовании шеечных мазков позволяет выделить группу риска развития раковых изменений(скрининговая функция).
2. Существенное количество вируса папилломы приводит к ВПЧ-зависимым ЦИН.
3. У женщин в возрасте до 30 лет более 90% ЦИН спонтанно регрессируют, тогда как у женщин среднего возраста, в связи с персистенцией ВПЧ, поражения регрессируют значительно реже.
4. Только у женщин с персистирующей ПВИ (ВПЧ высокого риска) возможно развитие РШМ.

Таким образом, у женщин старше 30 лет необходимы скрининг, улучшающий определение ВПЧ, и цитологическое исследование цервикальных мазков по Папаниколау. Только  при  одновременном  определении  отрицательного РАР- и ВПЧ-тестов можно делать вывод о регрессе патологии.

Молекулярные маркеры в скрининге на рак шейки матки. Перспективы

Как известно, ключевую роль в индукции цервикального канцерогенеза играют ранние белки ВПЧ Е6 и Е7: неконтролируемая экспрессия генов Е6 и Е7 в базальных и парабазальных слоях эпителия выводит из строя два ключевых белка клетки - р53 и pRb, соответственно, регулирующих клеточный цикл.

Современная концепция скрининга на РШМ ставит его основной задачей выявление пациенток с цервикальными интраэпителиальными повреждениями высокой степени (ЦИН II/III), которые в данный момент времени в медицинском вмешательстве не нуждаются. Теоретически можно выделить три уровня риска развития цервикального рака: 

• инфицирование онкогенными типами ВПЧ;
• появление в базальном и парабазальном слоях эпителия клонов клеток, в которых нарушена регуляция транскрипции вирусных онкогенов и, таким образом, инициирована дестабилизация гена;
• прогрессия этих клонов до популяций клеток с высоким уровнем нестабильности хромосом и затем до клеток инвазивного рака.

Основываясь на этих концептуальных положениях и принимая во внимание высокий показатель транзиторной ПВИ, можно утверждать, что самым эффективным подходом к ранней диагностике цервикального рака будет выявление популяции клеток, только что инфицированных для трансформации. Специфичные и чувствительные маркеры, способные точно идентифицировать эти клетки, позволят существенно повысить качество цервикального скрининга.

Белки человека, которые в норме не экспрессируются в клетках цервикального эпителия, но значительно интенсивнее синтезируются вследствие неконтролируемой экспрессии вирусных онкогенов, являются одной из сфер поиска эффективных маркеров. К числу таких белков относится pl6INK4A – ингибитор циклин-зависимой киназы. Инактивация pRb белком Е7 индуцирует значительное повышение экспрессии pl6INK4A по принципу обратной отрицательной связи. Белок pl6INK4A сейчас рассматривается как один из многообещающих маркеров диспластических изменений в клетках плоского и железистого эпителия цервикального канала.  
            Важным событием в цервикальном канцерогенезе считают интеграцию вирусной ДНК в геном хозяина. Процесс интеграции часто сопровождается нарушением интактности генов вируса Е1 и Е2, участвующих в регуляции экспрессии Е6 и Е7, вследствие чего экспрессия Е6 и Е7 значительно повышается. Полагают, что интеграция представляет собой активационный механизм прогрессии от дисплазии тяжелой степени к раку. Для выявления интегрированной формы вируса используются такие методы, как гибридизация in situ, ПЦР в реальном времени, обратно-транскриптазная ПЦР. Несмотря на противоречивость данных о формах вирусного генома на разных стадиях опухолевой прогрессии, которая отчасти может быть обусловлена разной чувствительностью используемых методов, как правило, на ранних стадиях опухолевого процесса вирусная ДНК обнаруживается в эписомальной форме, а на поздних стадиях — в интегрированной.

Еще одним подходом к идентификации потенциальных маркеров неопластической прогрессии является анализ эпигенетических изменений в хромосомах хозяина, являющихся прямым или непрямым следствием нерегулируемой экспрессии вирусных онкогенов. Примером таких изменений могут служить хромосомные аберрации, в результате которых инактивируются гены-супрессоры опухолевого роста. К инактивации этих генов может также приводить гиперметилирование их регуляторных последовательностей.

Можно ожидать, что с успехами в области изучения функций вирусных генов и генов человека, продукты которых взаимодействуют с белками вируса, список маркеров, обладающих реальным потенциалом для прогноза неопластической прогрессии, будет увеличиваться. Очевидно, что до внедрения в клиническую практику необходимо провести тщательную клиническую оценку всех предлагаемых маркеров. Детально спланированные молекулярные и эпидемиологические исследования помогут оценить диагностическую и прогностическую значимость предлагаемых маркеров и на основе самых надежных из них разработать эффективные скрининговые тесты.

Резюмируя представленную информацию, следует отметить, что правильная организация цитологического скрининга, а также выявление вируса папилломы человека играют существенную роль в скрининге на рак шейки матки. Снижение заболеваемости раком шейки матки может быть достигнуто также путем своевременной диагностики и адекватного лечения ее патологических состояний. Диагностика, направленная на прогнозирование патологии шейки матки, должна основываться на цитологическом методе, подкрепленном ПЦР-диагностикой на вирус папилломы человека и внедрением молекулярных маркеров.

Как известно, комплексный подход к профилактике рака шейки матки и борьбе против этого заболевания включает в себя различные виды воздействия в рамках широкого спектра мероприятий: от первичной профилактики посредством внедрения образовательных программ, направленных на снижение риска развития рака шейки матки, и вакцинации до раннего обнаружения, лечения и паллиативной терапии.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Особенностью лабораторной диагностики ВПЧ-инфекции является преимущественное использование молекулярно-биологических методов для обнаружения и идентификации ДНК ВПЧ, так как с помощью традиционных вирусологических методов вирус обнаружить невозможно.

Серологическое исследование также имеет ограничения. ВПЧ-инфекция сопровождается выработкой специфических антител к главному капсидному протеину, но антитела длительно циркулируют в крови, что вносит определенные трудности в интерпретацию результатов. Доступные тест-системы по большей части представляют собой варианты ИФА для выявления антител к белку L1. В процессе инфекции выявляются антитела в крови и в слизистых секретах. Интересно, что уровень ВПЧ-специфических антител классов IgG и IgA в эпителиальной ткани не коррелирует с элиминацией вируса. Обнаружение в плазме /сыворотке крови антител класса IgA совпадает с исчезновением вируса. При персистирующей инфекции у больных в крови обнаруживаются длительно циркулирующие антитела класса IgG.

Молекулярно-биологические методы диагностики папилломавирусной инфекции разрабатывались по двум направлениям:

• создание тест-систем для массового обследования женщин на ВПЧ с целью профилактики развития рака шейки матки, максимально поддающиеся автоматизации;

• создание тест-систем, позволяющих получать исчерпывающую информацию о течении ВПЧ-инфекции, необходимой при лабораторном мониторинге конкретной истории болезни и эпидемиологических исследованиях.

К первой группе тестов можно отнести ВПЧ  Digene-тест, который полностью автоматизирован, а также некоторые варианты ПЦР.

Ко второй группе тестов относятся методы, позволяющие определять генотипы ВПЧ (ПЦР), вирусную нагрузку (ПЦР в режиме реального времени), экспрессию онкогенных генов е6 и е7 (HPV OncoTect™ - тест, Invirkm Diagnostics LLC; "PreTect HPV-Proofer", Nor Chip) и другие.

Современные молекулярно-биологические методы позволяют обнаружить вирус, а также дают однозначный ответ на вопрос, каким генотипом ВПЧ произошло заражение, сколько генотипов присутствует одновременно, какова вирусная нагрузка, в какой форме присутствует вирус в эписомальной или интегрированной.

Методы детекции ДНК ВПЧ

Гибридизация in situ

ДНК ВПЧ может быть обнаружена непосредственно в эпителиальных клетках в цитологических мазках или биоптатах, взятых из пораженного эпителия кожи и слизистых с помощью гибридизации in situ. Этот метод основан на использовании меченых зондов, которые комплементарно гибридизуются с внутриклеточной ДНК ВПЧ. Хотя чувствительность метода имеет ограничения (25 копий ДНК ВПЧ на клетку), он позволяет определить локализацию вируса непосредственно в клетке. Однако в случае низкой копийности вируса в пораженной  ткани,  что  характерно,  например,  для  выраженной дисплазии шейки матки, метод дает ложно-отрицательные результаты. Метод  позволяет  также   одновременно   с  обнаружением  вируса определить генотип ВПЧ, если во время эксперимента используется смесь зондов, специфичных к ДНК различных генотипов ВПЧ.

ДНК ВПЧ также может быть выделена из клинического материала для постановки Саузерн-блота или гибридизации дот-спот. Однако такой подход не может быть автоматизирован и не подходит для массовых исследований. Ранее использующийся в качестве «золотого стандарта» Саузерн-блот в настоящее время вытеснен ПЦР.

ПЦР и её модификации

ПЦР (Amplicor HPV test, Roche Molecular Diagnostics) признана «золотым стандартом» диагностики ВПЧ-инфекции.

ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при +94°С происходит разделение цепей ДНК, затем при +56°С ... +60°С — присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре +72°С протекает синтез новых цепей ДНК. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для детекции.