Папилломавирусная инфекция

Наиболее распространенным методом детекции продуктов амплификации является гель-электрофорез. После завершения ПЦР реакционная смесь вносится в лунки агарозного геля, содержащего флуоресцентный краситель, и подвергается электрофоретическому разделению в специальной камере. Флуоресцентный краситель связывается с двухцепочечными молекулами ДНК и под действием ультрафиолетового света начинает светиться. Продукты амплификации можно визуализировать с помощью специальных приборов, например, видео-система «Gel Doc» фирмы BioRad.

При постановке ПЦР должны соблюдаться определенные требования для исключения ложно-положительных результатов. Это строгое разграничение и разобщение разных этапов работы по отдельным помещениям, строгое соблюдение правил пользования перчатками, халатами, лабораторным оборудованием в пределах помещения, предназначенного для каждого этапа исследования. При несоблюдении этих требований легко возникает перенос какого-либо количества уже амплифицированной ДНК в новую реакционную смесь, что приводит к появлению ложно-положительных результатов из-за повторной амплификации ранее полученных ампликонов.

Разработанный метод ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени  (real-time PCR)  позволил значительно расширить возможности молекулярной диагностики. В основе данного метода лежит накопление и регистрация флуоресцентного сигнала, возникающего в результате взаимодействия специфического гибридизационного ДНК-зонда с продуктом амплификации непосредственно в процессе реакции, т.е. в режиме реального времени. Реакционная смесь, помимо описанных выше компонентов, содержит гибридизационные ДНК-зонды, имеющие на одном конце флуоресцентную метку, а на другом гаситель флуоресценции. В отсутствии специфического продукта амплификации флуоресценция не выявляется, т.к. пространственная структура зонда обеспечивает тесный контакт флуоресцентной метки и гасителя. В процессе накопления продуктов амплификации происходит увеличение флуоресцентного сигнала, который регистрируется специальным оптическим модулем, встроенным в прибор для постановки real-time PCR. Кинетика накопления продуктов амплификации зависит от исходного количества искомой матрицы, что позволяет определить титр возбудителя. Чем больше ампликонов накапливается в результате реакции, тем выше уровень регистрируемого флуоресцентного сигнала, который обрабатывается с помощью программного обеспечения и отображается в виде кривой флуоресценции. Таким образом, наличие или отсутствие и титр возбудителя в клиническом материале определяются без проведения дополнительных манипуляций, связанных с извлечением продукта амплификации из пробирок и последующим анализом.

При постановке ПЦР в режиме реального времени отсутствие отдельной стадии детекции продуктов амплификации позволяет уменьшить риск контаминации продуктами ПЦР и, таким образом, упростить требования, предъявляемые к организации ПЦР-лаборатории. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах без выделения отдельного помещения для детекции продуктов амплификации.

Существует также вариант детекции флуоресцентного сигнала по конечной точке (endpoint analysis), который отличается от детекции в реальном времени тем, что амплификация проводится в обычных амплификаторах без оптического модуля, а уровень флуоресценции измеряется после проведения реакции в специальных флуоримет-рических детекторах.

Большинство разработанных тест-систем для выявления ДНК ВПЧ с помощью ПЦР содержат праймеры, специфичные к консервативной области вирусного генома, например, к последовательности гена l1, кодирующего белки капсида. Однако такое исследование не позволяет определить генотип вируса, так как искомая мишень является общей для всех ВПЧ.

Определение генотипа ВПЧ с помощью ПЦР основано на подборе праймеров к участкам в нуклеотидной последовательности генов е6 и е7, отличающих один генотип ВПЧ от другого. Список генотипов, которые можно выявить с помощью разработанных тест-систем определяется в зависимости от частоты встречаемости того или иного типа ВПЧ. Для практического генотипирования в группу высокого онкогенного риска включают HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66 и HPV-68; в группу низкого онкогенного риска - HPV-6, HPV-11, HPV-13, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-61, HPV-70, HPV-72, HPV-81 и HPV-89. Выделяют также группу промежуточного риска, в которую включены HPV-26, HPV-53, HPV-66, HPV-73 и HPV-82.

Все современные тест-системы содержат также праймеры для внутреннего контроля. Аналитическая чувствительность ПЦР колеблется между 10 и 200 копиями ВПЧ в образце в зависимости от типа ВПЧ и метода детекции продуктов амплификации.

Использование тест-систем для последовательного выявления ДНК определенного генотипа ВПЧ в настоящее время не находит широкого применения из-за ограничений в пропускной способности.

 

HPV Digene-тест (Digene Hybrid Capture System II)

Система двойной генной ловушки Digene Hybrid Capture System II -разработка фирмы Digene Corp., США использует РНК-ДНК гибридизацию в растворе с последующей "хвостовой" реакцией между гибридом РНК пробы - ДНК мишени и специфическими антителами к этому гибриду. Тест отличается высокой специфичностью, так как мишенью является весь геном вируса. Длинная одноцепочечная РНК эффективно гибридизуется со всеми 8000 нуклеотидами ДНК ВПЧ. Гибрид ДНК-РНК более стабилен, что позволяет избежать нежелательных побочных реакций. Источником дополнительной чувствительности в реакции является использование антител  к гибриду РНК-ДНК,  конъюгированных  с множеством молекул щелочной фосфатазы. Эти меченые антитела распознают короткие цепочки РНК-ДНК гибрида способом, который не имеет отношения к последовательностям нуклеотидов ДНК и РНК. Тысячи молекул антител могут покрыть единичный геномный гибрид ДНК ВПЧ. Каждый иммобилизованный энзим щелочной фосфатазы реагирует с множеством молекул хемилюминесцента диоксетана за 1 минуту и вызывает постоянный поток фотонов, которые прочитываются фотомультиплейерной трубкой люминометра. Система генной ловушки имеет преимущества перед амплификацией мишени, т.к. вовлекает большой объем (10-20%) клинического материала в реакцию. Интенсивность испускаемого света пропорциональна количеству ДНК ВПЧ и выражается как отношение сигнала к положительному контролю. Аналитическая чувствительность этого исследования составляет от 1 до 17,6 пг/мл в зависимости от типа ВПЧ. Это исследование стало уже стандартным в некоторых странах, широко используется в клинических исследованиях, а в США одобрено FDA как скрининговое исследование. На настоящий момент созданы уже модификации метода 4-го поколения. Дизайн постановки включает полную автоматизацию.

Однако метод имеет ряд ограничений. Исследование не позволяет определять наличие определенного генотипа, а лишь проводит дифференциацию между двумя группами вирусов ВПЧ. Это группа низкого онкогенного риска (HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43, HPV-44) и группа высокого онкогенного риска (HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59 и HPV-68). Внутри групп генотип ВПЧ не определяется. Предел чувствительности метода составляет приблизительно 5000 геном-эквивалентов, что существенно ниже чувствительности ПЦР. При низкой вирусной нагрузке могут наблюдаться ложно-отрицательные результаты.

Кроме того, возможны перекрестно-реагирующие реакции в случае высокой концентрации ДНК (4 нг/мл и выше) ВПЧ генотипов 13, 6 и 42 из группы низкого онкогенного риска с реактивами для выявления ВПЧ из группы высокого онкогенного риска.

ВПЧ Digene-тест второго поколения и выше позволяет не только выявить присутствие высокоонкогенных типов ВПЧ, но и определить клинически значимую концентрацию ДНК в эпителиальной ткани, которая может служить прогностическим критерием развития заболевания и определить тактику врача в каждой конкретной ситуации.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ДИСПЛАЗИИ

 

Эффективной стратегией, позволившей снизить летальность в связи с раком шейки матки или раком другой локализации, является регулярное профилактическое обследование с целью выявления папилломавирусной интраэпителиальной дисплазии. Развитие ВПЧ-индуцированного рака - процесс медленный, патологический процесс развивается в течение многих лет. В течение этого периода возможно обнаружение предраковых клеток.

Диагностика папилломавирусной инфекции (ПВИ) с целью профилактики рака шейки матки включает комплекс клинико-лабораторных методов исследования.

 

Клинический осмотр

 

При клиническом осмотре наружных половых органов возможно выявление бородавок, остроконечных кондилом. При осмотре влагалища и шейки матки выявляются различные изменения, характерные для ПВИ. При осмотре шейки матки в зеркалах можно определить невооруженным глазом участки очаговой гиперплазии эпителия в виде белесых бляшек. Для исключения эндоуретральных кондилом иногда проводится уретроскопия. При визуальном обследовании и при расширенной кольпоскопии используют тест с 3-5% уксусной кислотой и раствором Люголя.

Тест с уксусной кислотой считается положительным, если после обработки на влагалищной части шейки матки появляются белые пятна. Уксусная кислота коагулирует белки, делая клетки белыми и непрозрачными. Нормальный плоский эпителий после обработки уксусной кислотой не изменяется. Участки дисплазии, цилиндрического эпителия, метапластического эпителия дают положительную пробу с уксусной кислотой.

Положительная проба Шиллера - это выявление неокрашенных или неравномерно окрашенных йодным раствором Люголя измененных участков эпителия шейки матки. Нормальный многослойный плоский эпителий под воздействием раствора Люголя равномерно окрашивается в темно-коричневый цвет. Атипически измененный   эпителий   можно   увидеть   невооруженным глазом.

Положительные тесты с уксусной кислотой и раствором Люголя являются основанием для направления пациентки на кольпоскопическое исследование.

 

Кольпоскопия

 

Кольпоскопия и биопсия показаны всем женщинам с цервикальной интраэпителиальной неоплазией класса II (ЦИН II) и класса III (ЦИН III), независимо от подтверждения у них наличия ВПЧ-инфекции. Выделяют 5 классов кольпоскопических картин: нормальные, аномальные, неясные (неудовлетворительная кольпоскопия), подозрительные на рак и смешанные (разные). Кольпоскопическими признаками ПВИ шейки матки являются ацетобелый эпителий, лейкоплакия, пунктация, белые выросты и мозаика, жемчужная поверхность после обработки уксусом, атипические сосуды, йод-негативные участки после обработки раствором Люголя.

 

Цитологическое исследование - мазок по Папаниколау

 

Мазок по Папаниколау - один из эффективных методов выявления рака шейки матки и предшествующих ему состояний. Согласно эпидемиологическим наблюдениям, рак шейки матки развивается в 2-10 раз чаще у женщин, которым не выполняется это исследование. После введения обязательного регулярного цитологического обследования удалось резко снизить смертность от рака шейки матки. За последние 50 лет этот показатель снизился на 70%. Массовое профилактическое обследование цервикальных мазков по Папаниколау - это пример самого успешного скринингового теста в истории медицины.

 

Методика забора мазка по Папаниколау

Соскоб с поверхности экзоцервикса, влагалища, вульвы берут специальным шпателем. Материал из эндоцервикса берут смоченным в физиологическом растворе ватным тампоном или цервикальной щеточкой - эндобрашем. Щеточкой удается взять в 7 раз больше клеток. Чтобы получить информативный мазок, нужно соблюсти следующие правила:

• Материал для мазка берут перед бимануальным исследованием;

• Сначала проводят забор материала для цитологического исследования, а потом - для выявления возбудителей инфекций, передающихся половым путём;

• При обильных выделениях из половых путей перед исследованием их удаляют большим тампоном;

• Сначала берут соскоб с шейки матки, а потом из цервикального канала;
• Допустимо два образца (с экзоцервикса и эндоцервикса) наносить на одно стекло;
• Небольшие кровянистые выделения не влияют на результат цитологического исследования, но при обильном кровотечении забор материала следует отложить.

Полученный материал равномерно распределяют тонким слоем по специально обработанному обезжиренному предметному стеклу, чтобы не было комков, и немедленно фиксируют, пока мазок еще не высох, смесью эфир/96% этиловый спирт или только 96% этиловым спиртом. При использовании фиксирующих аэрозолей головку распылителя следует держать на расстоянии не менее 25 см от предметного стекла, чтобы не нарушить расположение клеток.

Рак прямой кишки тоже вызывается вирусом папилломы человека. Мазок по Папаниколау и в данном случае представляет собой эффективный скрининговый метод.

Для получения анального мазка в анус вводят щеточку, вынимают её вращательным движением, соскабливая клетки, а затем фиксируют полученные клетки на предметном стекле или в специальном растворе. Чувствительность этого метода составляет 69-93%, а специфичность – 32-59%; эти величины сопоставимы с чувствительностью и специфичностью цитологических мазков из шейки матки.

 

Цитологическое исследование монослойных Пап-препаратов

Для повышения информативности Пап-мазков были разработаны и внедрены в практику новые технологии забора материала и подготовки цитологических мазков. Например, в США используются специальные наборы для приготовления мазка по методу Папаниколау. Это система PrepStain, ранее выпускавшаяся под названием AutoCyte, и система ThinPrep. В системе PrepStain цервикальные соскобы собирают в специальный раствор на основе этанола, центрифугируют в градиенте плотности для получения гомогенной концентрированной фракции эпителиальных клеток без примеси нейтрофилов и разрушенных клеток. В системе ThinPrep материал также сразу помещают в забуференный спиртовой раствор. В лаборатории тонкий слой суспензии помещается на стекло с помощью мягкого центрифугирования. Микропроцессор регулирует количество клеток, наносимых на стекло.

Методы жидкостной цитологии снижают вероятность приготовления мазков, непригодных для исследования, предотвращают деформацию клеток из-за высыхания, удаляют слизь, гной, эритроциты, бактерии, дрожжи и позволяют готовить однородный эпителиальный монослой, который легче анализировать. Это повышает чувствительность цитологического исследования и снижает количество ложно-отрицательных результатов.

Для практического применения доступны также автоматизированные компьютеризированные системы обработки мазков и цитологической картины (Avto PaP 300QC, NeoPath и PapNet, Neuromedical). Системы выводят изображение клеток на экран монитора, оснащены программным обеспечением анализа изображения и позволяют оценивать степень плоскоклеточных интраэпителиальных поражений по классификации Bethesda.