Папилломавирусная инфекция

Другим подходом повышения информативности цитологического исследования является одновременная оценка цитологической картины и выявление ВПЧ в клетках с признаками атипии после иммунохимического окрашивания. Пример - автоматизированная модульная система BenchMark (Ventana Medical Systems, Tucson), которая выявляет ВПЧ высокого онкогенного риска (HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-59 и HPV-70) и ВПЧ низкого онкогенного риска (HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43 и HPV-44).

 

Оценка цитологической картины

Цитологические мазки окрашиваются по методу Папаниколау и просматриваются с помощью световой микроскопии (табл.4).

 

Таблица 4. Критерии оценки состояния эпителия.

 

Цитологическая оценка			Гистология
Bethesda System, 1999	Bethesda System, 1991	Папаниколау	Степень ЦИН
NILM Атипические клетки отсутствуют	WNL В пределах нормы	1-й класс Атипические клетки отсутствуют, нормальная цитологическая картина	Норма
ASC-US Атипия плоского эпителия неопределенной значимости.	ASCUS/AGUS	2-й класс Изменение клеточных элементов обусловлено воспалительным процессом во влагалище и (или) шейки матки
ASC-H Признаки атипии плоского эпителия, не исключающие HSIL   LSIL Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени выраженности	Атипия плоского эпителия неопределенной значимости	3-й класс Имеются единичные клетки с изменениями соотношения ядра и цитоплазмы, диагноз недостаточно ясен, требуется повторение цитологического исследования или необходимо гистологическое исследование биоптата для изучения состояния шейки матки
LSIL Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени выраженности	LSIL Плоскоклеточое интраэпителиальное поражение низкой степени выраженности	4-й класс Обнаруживаются отдельные клетки с признаками злокачественности, а именно с увеличенными ядрами и базофильной цитоплазмой, неравномерным распределением хроматина	ЦИН I
HSIL	HSIL	5-й класс	ЦИН II/III
Плоскоклеточное	Плоскоклеточное	В мазке имеются
интраэпителиальное	интраэпителиальное	многочисленные
поражение высокой	поражение	атипические клетки
степени выраженности	высокой степени
(рак in situ)	выраженности (рак in situ)

 

 

Тактика цитологического обследования

Группами экспертов США, Европы, ВОЗ разработаны алгоритмы цитологического обследования.

Эксперты CDC (США) рекомендуют начинать цитологическое исследование мазков из шейки матки по Папаниколау у женщин не позднее истечения 3-х лет с момента первого полового акта и в возрасте не позже 21 года; далее ежегодно до 30-летнего возраста. Если при цитологическом исследовании не было выявлено патологии, то последующая кратность постановки теста может быть раз в 2-3 года до 65 лет. В Европейском руководстве рекомендуется начинать скрининговое обследование женщин с 20-30 лет, периодичность обследования - один раз в 3-5 лет до 60-65 лет; профилактическую диагностику прекращают при наличии у обследуемой 3-х и более отрицательных результатов цитологического теста при достижении ею 65 лет.

Группами экспертов США, Европы, ВОЗ предложены алгоритмы ведения пациентов с патологическими результатами цитологического исследования, основанные на Терминологической системе Бетесда. Алгоритм обследования пациенток с отклонениями в цитологической картине зависит от степени патологических изменений (табл.5).

 

Таблица 5. Алгоритм обследования пациентов с отклонениями в

Пап-мазках по терминологической системе Бетесда.

 

Цитологическая оценка	Тактика дальнейшего обследования
ASC-US	тест на ДНК ВПЧ, повторный Пап-мазок; женщинам старше 20 лет рекомендуется кольпоскопия
ASC-H	кольпоскопия или биопсия
LSIL	повторное цитологическое обследование или кольпоскопия
HSIL	кольпоскопия и гистологическое исследование биоптата; в США - незамедлительная диагностическая экцизия

 

Если в мазке найдены атипичные клетки неясного значения (ASC-US) при позитивном тесте на ДНК ВПЧ необходимо проведение кольпоскопии или биопсии. При отсутствии морфологически подтвержденных ЦИН/рака рекомендуется повторное цитологическое исследование через 6-12 месяцев или ВПЧ ДНК-тест через 12 месяцев.

Атипичные клетки плоского эпителия (ASC-H), не позволяющие исключить HSIL (высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения), предполагают немедленное кольпоскопическое исследование или биопсию. При отсутствии ЦИН/рака даже после неоднократного пересмотра цитологических, гистологических и кольпоскопических данных, рекомендуется также повторное цитологическое исследование через 6-12 месяцев или ВПЧ ДНК-тест через 12 месяцев.

При выявлении LSIL (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени выраженности) необходима кольпоскопия, а при отсутствии визуальных признаков поражения шейки матки - получение цервикального материала с помощью цервикальной щетки или кюретажа. У подростков с LSIL возможно проведение кольпоскопии с повторной цитологией через 6 месяцев или ВПЧ-тестирование через 12 месяцев. У женщин в постменопаузе при наличии цитологических и клинических признаков атрофии с отсутствием противопоказаний к терапии эстрогенами желательно перед повторным цитологическим исследованием для подтверждения интраэпителиальных поражений провести курс интравагинальной терапии эстрогенами.

Цитологический диагноз HSIL (плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени тяжести) требует обязательной кольпоскопии и получения эндоцервикального образца с последующим морфологическим исследованием. Если при кольпоскопии поражение не визуализируется, а повторная цитология подтверждает HSIL, возможно проведение диагностической эксцизии. При цитологическом диагнозе HSIL и кольпоскопических изменениях шейки матки необходимо сразу проводить диагностическую эксцизию.

 

Гистологическое исследование

 

Прицельная биопсия шейки матки и выскабливание цервикального канала с гистологическим исследованием - основной метод диагностики  ЦИН.  Ревизия цервикального  канала показана всем пациенткам для исключения поражения эндоцервикса.

Гистологическое исследование биоптатов позволяет подтвердить большинство случаев ВПЧ-инфекции и выявить характерные гистологические признаки патологии:

• гиперплазия эпителия - умеренное утолщение рогового слоя с папилломатозом, паракератозом и акантозом;
• наличие в глубоких участках мальпигиева слоя койлоцитов - больших эпителиальных клеток с круглыми гиперхромными ядрами и выраженной перинуклеарной вакуолизацией.

Гистологическое исследование может быть комбинировано с одновременным выявлением антигенов ВПЧ, ДНК и РНК ВПЧ, определением вирусной нагрузки и др.

Для выявления антигенов доступны моноклональные и поликлональные антитела к белку капсида L1 различных фирм-производителей. Связавшиеся антитела выявляют затем вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (вариант ИФА), либо флюоресцентной меткой (вариант НИФ). Антигены, как правило, обнаруживаются в ядре зараженных клеток, но могут также локализоваться в цитоплазме койлоцитов.

Гистологическое исследование может быть дополнено гибридизацией in situ, позволяющей выявить присутствие в ткани ДНК и РНК ВПЧ. Гибридизация in situ основана на использовании меченых зондов, комплементарных к определенному участку нуклеиновой кислоты ВПЧ. В зависимости от того, чем помечен зонд (радиоизотопной меткой, флуоресцентной меткой, химическим лигандом) ДНК или РНК ВПЧ можно обнаружить с помощью радиографического, флуоресцентного или иммуноферментного анализа. Особенности сигнала позволяют дифференцировать эписомальную или интегрированную форму существования ДНК вируса. Интенсивность сигнала позволяет оценить вирусную нагрузку. Пример - Gen-Point system (Dako, Trappes, Франция) - автоматизированная система обнаружения ДНК ВПЧ в биоптатах, фиксированных формалином или заключенных в парафин.

 

Молекулярно-биологические методы диагностики

 

Кольпоскопическое, цитологическое и гистологическое обследования могут быть дополнены методами молекулярной диагностики.

В настоящее время разработаны молекулярно-биологические тесты, позволяющие выявить ДНК и РНК папилломавирусов, типировать ВПЧ, определять вирусную нагрузку, дифференцировать эписомальную и интеграционную форму персистенции вируса, выявлять активность генов онкогенных белков Е6 и Е7, а также определять состояние инфицированных клеток.

 

ДНК ВПЧ-тест

Методы детекции ДНК ВПЧ из группы высокого онкогенного риска в пораженной эпителиальной ткани - ВПЧ Digene-тест (Digene Corporation.), ПЦР (Amplicor HPV test, Roche Molecular Diagnostics) и их аналоги под общим названием ДНК ВПЧ-тест включены в программы по раннему выявлению предраковых состояний и рака шейки матки. Эти тесты прошли клиническую валидацию как самостоятельные скриниговые тесты и как тесты, дополняющие цитологическое исследование.

ДНК ВПЧ-тест рекомендуется использовать как:

• скрининговый
• диагностический
• для контроля эффективности лечения.

Введение ДНК ВПЧ-теста в скрининговые программы по выявлению рака шейки матки и предшествующих ему состояний приводит к более раннему обнаружению ЦИН II и ЦИН III у женщин в возрасте старше 30 лет. Как скрининговый ДНК ВПЧ-тест используется при обследовании женщин старше 30 лет.

ДНК ВПЧ-тест не рекомендуется использовать в качестве самостоятельного диагностического критерия для неопластических процессов шейки матки без цитологического исследования. Использование этого метода без учета результатов цитологии приводит к гипердиагностике, так как примерно в 80% случаев инфицирование имеет кратковременный характер и заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. Однако ДНК ВПЧ-тест приобретает большую диагностическую и прогностическую значимость, если на фоне ВПЧ-инфекции уже имеется картина дисплазии эпителия. Как самостоятельный диагностический ДНК ВПЧ-тест используется при обследовании пациенток с ASC-US, так как в этом случае он обладает большей информативностью для прогноза развития рака шейки матки, чем повторное цитологическое обследование.

ДНК ВПЧ-тест, в сочетании с цитологическим обследованием, информативен при обследовании пациенток с ЦИН П/Ш после лечения для контроля эффективности лечения.

 

 

Типирование папилломавирусов

Для эпидемиологического и клинического мониторинга выявленных случаев папилломавирусных инфекций важно проводить типирование онкогенных папилломавирусов.

Как уже обсуждалось выше, скрининговые тест-системы для выявления ДНК ВПЧ определяют принадлежность папилломавирусов к той или иной группе онкогенного риска без уточнения типа вируса внутри группы.

Однако степень риска развития рака напрямую зависит от принадлежности ВПЧ к тому или иному типу из группы высокого онкогенного риска, от инфицирования несколькими типами ВПЧ одновременно. Наиболее онкогенными являются HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 и HPV-45, среди которых HPV-16 обнаруживается в 70% случаев рака, HPV-18 - в 10%, выявление HPV-31 и HPV-45 при раке достигает 4%, HPV-33 - в 2% случаев. Таким образом, инфицирование HPV-16 и HPV-18 значительно чаще приводит к развитию рака шейки матки.

Типирование ВПЧ позволяет также выявить персистенцию онкогенных папилломавирусов, на которую указывает неоднократное повторное обнаружение одного и того же генотипа вируса. Длительная персистенция HPV-16 и HPV-18 является маркером повышенного риска развития рака шейки матки.

 

Определение формы персистенции ВПЧ

Известно, что ВПЧ может присутствовать в зараженной клетке в виде эписомальной ДНК (доброкачественная форма персистенции ВПЧ) или в виде ДНК, интегрированной в хромосому клетки-хозяина (злокачественная форма персистенции). Форма персистенции ВПЧ в инфицированном эпителии может быть определена с помощью ПЦР в режиме реального времени по относительному соотношению генов е2 и е6. Интеграция сопровождается делецией большого сегмента вирусного генома, что приводит к разрушению генов el и е2. Целостность генов е6 и е7 не нарушается (рис. 7).

 

Рис. 7. Формы персистенции ДНК ВПЧ и их соотношение при разных стадиях ПВИ.

 

Выявление формы персистенции важно для прогноза заболевания. При ЦИН I ДНК ВПЧ выявляется преимущественно в эписомальной форме, а соотношение генов е2/е6 составляет в среднем 0,91 (диапазон разброса показателя 0,54-1,02). При выраженной дисплазии ДНК ВПЧ выявляется или в смешанной форме, или только в интегрированной, соотношение е2/е6 составляет в среднем 0,61 (0-1,08). При карциноме ДНК ВПЧ интегрирована в хромосому зараженной клетки, соотношение е2/е6 - 0,02 (0-0,17).

 

 

 

Определение вирусной нагрузки

Еще одним критерием для прогноза развития рака является определение титра высокоонкогенных ВПЧ на фоне дисплазии эпителия. Изменения титра вируса хорошо изучено на примере канцерогенеза, индуцированного HPV-16. Титр HPV-16 (ДНК копии на клетку) возрастает при прогрессии ЦИН, но уменьшается при карциноме. Для репликации вирусного генома необходима активность генов el и е2. При карциноме вирус существует в виде интегрированной ДНК, репликация геномной ДНК резко снижается (рис.8).