Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну

Escherichia coli

Випробування  проводять методом прямого висівання.

Проведення  роботи: вносимо у 100 мл рідкого поживного  середовища №3 і інкубують при  температурі від 35 ºС до 37 ºС від 18 год до 24 год. Після закінчення інкубації робимо пересівання на густе живильне середовище і інкубуємо при температурі від 35 ºС до 37 ºС від 18 год до 24 год. Ріст характерних малинових колоній з металевим блиском (або без нього), або рожевих колоній діаметром від 2 мм до 4 мм. Це вказує на наявність E. coli.

Salmonella

Випробування  проводять методом прямого висівання.

Проведення  роботи: 10 мл зразка, підготованого, вносимо  у 100 мл рідкого поживного середовища і інкубуємо при температурі  від 35 ºС до      37 ºС від 18 год до 24 год. Після закінчення інкубації робимо пересівання      1 мл з агаризованого середовища у 10 мл рідкого поживного середовища і інкубуємо при температурі від 35 ºС до 37 ºС від 18 год до 24 год. Після закінчення періоду інкубації робимо пересівання із рідкого середовища на поверхню густого середовища (чашки Петрі) і інкубуємо при температурі  від 35 ºС до 37 ºС від 18 год до 48 год.

Наявність росту  на середовищі чорних колоній із характерним  металевим блиском, під якими  ділянка середовища профарбується у чорний колір, або світлих зеленуватих колоній указує на можливість забруднення Salmonella.

Staphylococcus aureus

Випробування  проводять методом прямого висівання.

Проведення  роботи: готуємо випробовуваний зразок (як описано вище). Підготований зразок у кількості, відповідній 1 г або 1 мл, носять у 100 мл живильного середовища, гомогенізуємо і інкубуємо при температурі від      35 ºС до 37 ºС від 18 год до 24 год. Після закінчення періоду інкубацію робимо пересівання на чашку з густим живильним середовищем і інкубуємо при температурі від 35 ºС до 37 ºС від 18 год до 48 год. Ріст золотаво-жовтих колоній, оточених жовтими зонами (що свідчать ферментацію маніту), вказує на можливість забруднення культуральної рідини.

Pseudomonas aeruginosa

Випробування  проводять методом прямого висівання.

Проведення  роботи: зразок у кількості, відповідній 1 г або 1 мл лікарського засобу, вносимо  у 100 мл живильного середовища, гомогенізуємо  і інкубуємо при температурі  від 35 ºС до 37 ºС від 18 год до 24 год. Після закінчення періоду інкубації проводимо пересівання на чашку з густим живильним середовищем та інкубуємо при температурі від 35 ºС до 37 ºС від 18 год до 48 год. Ріст зеленуватих, як правило, флуоресціюючих колоній, блакитних в ультрафіолетовому світлі (що свідчить про наявність пігменту піоціаніну), вказує на можливість забруднення культуральної рідини.

Частота перевірки  стерильності культуральної рідини приблизьмо кожних 4 години. Після інкубації  посівів на середовищах МПА не повинен бути виявлений ріст сторонньої мікрофлори [2].

Наявність гризеофульвіну в середовищі

Спочатку проводимо  екстракцію гризеофульвіну: П’ять мілілітрів культуральної рідини (розведена в 50 разів) центрифугують (4000 оборотів в хвилину, 10 хвилин), щоб відокремити клітини від культуральної рідини. Потім клітини переносять в колбу на 100 мл та додають 8 г KOH і 32 мл 60% розчину етанолу. Для омилення суміш витримують на водяній бані при температурі 80 ± 2 °С протягом 2 годин. Для вилучення гризеофульвіну додають 25 мл петролейного ефіру.

Концентрацію  цільової речовини визначають методом  високоефективної рідинної хроматографії, оскільки це найбільш ефективний метод  аналізу. ВЕРХ використовує прикладання зовнішнього тиску для прискорення проходження рідини через колонку. Це дозволяє застосовувати наповнювач з часточками меншого розміру й прискорює розділення (зазвичай 3 – 5мкм)

Суть методу полягає в розділенні складних сумішей  між рухомою і нерухомою  фазами, що не змішуються. Суміші нерівно розподіляються завдяки різній полярності рідин або іншим властивостям. Колонка, що використовується, для визначення антибіотика, являє собою стальну трубку діаметром 5 − 25 мм наповнену нерухомою фазою. В даному експерименті будемо користувавсь колонкою фірми „Silufol” UV-254 (Чехія) Для визначення гризеофульвіну, нерухомою фазою виступає модифікований силікагель, в якості рухомої – розчин ацетонітрил. Колонки розраховані на тиск порядку 150 атм [3].

Після проведення першого етапу виділення, відбувається повторне хроматографічне очищення при підкисленні елюента розчином сірчаної кислоти до рН 4,5. Гризеофульвін, що міститься в елюаті осаджують метанолом у формі сульфату. Час експерименту триває 25 – 30хв.

При культивуванні штаму P. griseofulvinum MTCC 2004 концентрація гризеофульвіну повинна бути в межах 480 − 540 мг/мл [19].

Список  використаної літератури:

1. Буценко Л.М., Пенчук Ю.М., Пирог Т.П. Технології мікробного синтезу лікарських засобів. – Київ, – НУХТ, 2010. – 323 с.
2. Безглуздий П.О., Українець І.В., Таран С.Г. Фармацевтична хімія – Харків, – НФАУ, 2002. – 448 с.
3. Васілевський О.М., Дідич В.М. Елементи теорії побудови потенціометричних засобів вимірювального контролю активності іонів з підвищеною вірогідністю. – Вінниця, – ВНТУ, 2013. – 23с.
4. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М. : Мир, 2002. – 589 с. 
5. Зуй М.Ф. Хімічний склад та аналіз компонентів грунтів.– М.: Наука, 2003. – 126с.
6. Егоров Н.С. Биотехнология: проблемы и перспективы. – М.: Высшая школа, 1997. − 282 с.
7. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. – М.: Наука, 2004. – 525 с.
8. Пирог Т.П, Ігнатова О.А. Біосинтез вторинних метаболітів. Антибіотики. Загальна біотехнологія – Київ, – НУХТ, 2009. – 328 с.
9. Поводзинський В.М. Основи проектування біотехнологічни виробництв. – Київ, – НУХТ, 2006. – 88 с.
10. Болотная Л.А., Шмелькова Е.С. Оптимизация местной терапии при дерматофитиях // Український журнал дерматології, венерології, косметології. – 2011. – Т. 42, № 3. – С. 87– 92. (дод.3)
11. Короленко В.В. Сучасний стан проблеми мікозів та застосування сертаконозолу в їх лікуванні // Український журнал дерматології, венерології, косметології. – 2010. – Т. 38, № 3. – С. 109– 116. (дод.4)
12. Кравец Е.В. Cлучаи микроспории волосистой части головы у взрослых // Український журнал дерматології, венерології, косметології. – 2012. – Т. 46, № 3. – С. 40 – 48. (дод.5)
13. Леутенко К.В. Видове різноманіття пліснявих грибів у приміщеннях університету. // Фармація - 2009. – Т. 32, № 3 - С 34-40 (дод.6)
14. Патика П.В. Грибковые биотехнологии для промышленности, сельского хозяйства и медицины // Химия и жизнь. – 2004. – Т. 38, № 8. – С. 69– 89.
15. Таутова Е. Н., Хамитова А. С.,Николаева М. И. Изучение русловий культивирования почвенных грибов – продуцентов ценных антибиотиков // Микробилогия – 2011. – Т. 21, № 6. – С. 5 – 9. (дод.7)
16. Шкундина.И.С. Достижения в области Грибковые биотехнологии для промышленности, сельского хозяйства и медицины. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. 2005. – Т. 41, № 9. – С. 471 – 476.
17. Шмелькова Е.С. Современное комплексное лечение при атипичных формах микроспории // Український журнал дерматології, венерології, косметології. – 2012. – Т. 23, № 6. – С. 23 – 30. (дод.8)
18. Fernandez F. Microbial secondart metabolites production and strain improvement // Biotechnology. 2003 – № 2. – P. 322 – 333(дод.9)
19. Gerten K., Fesdonlin S. Optimization of microbiological parameters for enhanced griseofulvin production using response surface methology // Bioprocess and biosystems engineering. – 2000. – Vol. 22, № 1. – P. 45 – 49. (дод.1)
20. Lang S. First Report of Penicillium griseofulvum Causing Blue Mold on Stored Apples in Italy (Piedmont) // APSnet. – 2010. – Vol. 17, № 2. – P. 44– 53. (дод.10)
21. Нungis. G. Factors determining the biosynthesis of griseofulvin and the similar substance // Folia Microbiologica. – 2001. – Vol. 6, № 7.– P. 262 – 267. (дод.11)
22. Rebacz B. Idebtification of griseofulvin in as inhibitor of centrosomal clustering in a phetonoty pe-based screen // Cancer Researth. – 2007. – Vol. 5, № 8. – P. 21 – 28 (дод.12)
23. Rosenberg E. Production and griseofulvin patulin by strain Penicillium griseofulvinum in three different media //. Mycopathologia – 2001. – Vol. 89, № 2. – P. 85– 89. (дод.13)
24. Taub D., Kuo H., Wendler N. A total sythesisofn griseofulvin and its optical antipode // Tetrahedron. – 1963. – Vol. 2, № 19. – P. 1 – 17. (дод.2)
25. www.genome.jp / kegg / KEGG : Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Pathway Database.
26. www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/GenBank/Penicilin
27. А12008652ЕР, А1ЕР31/06. Griseofululvum in analogues for the Therment of cacer by inhibition of cenrosomal / Kramer A., Rebacz B., Clausen H. – Опубл. 10.06.2007, Бюл. № 62 (дод.14)
28. PL20249/0009 Fulsovin 125mg/5ml oral suspension / Medicines and Healthcare products Regulatory Agency. – Опубл. 23.01.2013 (дод.15)