Проявление окислительного стресса при действии неблагоприятных температур

Одним из важнейших ферментов  внутренней мембраны митохондрий является цитохром-с - оксидаза  (ЕС 1.9.3.1) - терминальный участок дыхательной цепи, сопряженной  с целью окислительного фосфорилированил.

Исследование состояния  этого фермента в тканях после замораживания свидетельствует о снижении его активности [26]

 

1.3.2 Влияние  повышенной температуры на растения

 

Для большинства растений наиболее благоприятными для жизни  являются температуры +15…+30 ^оС. При температуре +35…+40 ^оС большинство растений повреждаются.

Действие высоких температур влечет за собой целый ряд опасностей для растений: сильное обезвоживание  и иссушение, ожоги, разрушение хлорофилла, необратимые расстройства дыхания  и других физиологических процессов, прекращение синтеза белков и усиление их распада, накопление ядовитых веществ, в частности аммиака. При очень высоких температурах резко повышается проницаемость мембран, а затем наступает тепловая денатурация белков, коагуляция цитоплазмы и отмирание клеток. Перегрев почвы приводит к повреждению и отмиранию поверхностно расположенных корней, к ожогам корневой шейки.

Первичные изменения  клеточных структур происходят на уровне мембран в результате активации  образования кислородных радикалов  и последующего перекисного окисления  липидов, нарушения антиоксидантной системы - активности супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы и других ферментов. Это вызывает разрушение белково-липидных комплексов плазмалеммы и других клеточных мембран, приводит к потере осмотических свойств клетки. В результате наблюдаются дезорганизация многих функций клеток, снижение скорости различных физиологических процессов. Так, при температуре 20 ^оС все клетки проходят процесс митотического деления, при 38 ^оС митоз отмечается в каждой седьмой клетке, а повышение температуры до 42 ^оС снижает число делящихся клеток в 500 раз.

При максимальных температурах расход органических веществ на дыхание  превышает его синтез, растение беднеет  углеводами, а затем начинает голодать. Особенно резко это выражено у  растений более умеренного климата (пшеница, картофель, многие огородные культуры). При общем ослаблении повышается их восприимчивость к грибковым и вирусным инфекциям.

Даже кратковременное  стрессирующее действие высокой  температуры вызывает перестройку  гормональной системы растений. На примере проростков пшеницы и гороха установлено, что тепловой шок индуцирует целый каскад многоступенчатых изменений гормональной системы, который запускается выбросом ИУК из пула ее конъюгатов, выполняющего роль стрессового сигнала и инициирующего синтез этилена. Результат синтеза этилена - последующее снижение уровня ИУК и увеличение АБК. Эти гормональные перестройки, очевидно, индуцируют синтез ферментов антиоксидантной защиты и белков теплового шока, вызывают снижение темпов роста и как следствие - повышается устойчивость растения к действию высоких температур.

Существует определенная связь между условиями местообитания  растений и жароустойчивостью. Чем  суше местообитание, тем выше температурный  максимум, тем больше жароустойчивость растений.

К воздействию высоких  температур растения могут подготовиться  за несколько часов. Так, в жаркие дни устойчивость растений к высоким  температурам после полудня выше, чем утром. Обычно эта устойчивость временная, она не закрепляется и  довольно быстро исчезает, если становится прохладно. Обратимость теплового воздействия может составлять от нескольких часов до 20 дней.

Жароустойчивость связана  также со стадией развития растений: молодые, активно растущие ткани  менее устойчивы, чем старые. Особенно опасны высокие температуры в период цветения. Практически все генеративные клетки в данных условиях претерпевают структурные изменения, теряют активность и способность к делению, наблюдается деформация пыльцевых зерен, слабое развитие зародышевого мешка и появление стерильных цветков [29].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Материалы  и методы исследования

 

2.  Материал исследования

 

В качестве материала  исследования служили семена томата сорта Волгоградский 5/95. Сорт Волгоградской опытной станции ВИРа получен методом отбора из гибрида Кубань х Черноморец 175. Сорт районирован в 1953 году. Скороспелость: сорт среднепоздний, созревание плодов наступает на 116-130 день после появления всходов. Урожайность: до 10.0 кг/м2. Томат Волгоградский 5/95 высотой 70-110 см. Растение штамбовое, индетерминантное, компактное. Плоды плоскоокруглые, гладкие и слаборебристые, красные, массой 90-150 грамм, число гнезд 5-8. Этот сорт томатов ценится за высокую стабильную урожайность и хорошее качество. Волгоградский томат среднеустойчив к поражению болезнями.

 

2.  Изучение ростовых параметров растений томатов

 

Семена  испытуемого растения замачивали в  растовых препаратах Рибав-Экстра (10 ^-5 %), 6 БАП (1 мг\л) и воде (контроль) в течении 16 часов, после чего высаживали по 10 штук в сосуды с почвой и выращивали до появления 3-10 настоящего листа. Температуру поддерживают в интервале 23 ⁰С, освещение поддерживают люминистентными лампами с  интенсивностью 200лк, влажность воздуха около 80 %, продолжительность светового дня 12 часов. После достижения 3-го настоящего листа (возраст 20-21 сут) сосуды с растениями помещают на 16 часов в условиях экстримальных температур: в холодильнике при температуре 2 ⁰С и термостате при температуре 43 ⁰С, температурный контроль комнатная температура. Попрошествии этого времени  растения из неблагоприятных температур растения переносят в оптимальные тепмературные условия. На 7 сутки после возврата в оптимальную температуру производили измерения ростовых параметров длины корня, побега, количество листьев и их площадь.

 

3. Определение интенсивности ПОЛ

 

Интенсивность ПОЛ в листьях растений оценивали по накоплению продуктов окисления малонового (МДА) по цветной реакции с тиабарбетуловой кислотой (ТБК). Для определения содержания МДА навеску листьев 0,3 г гомогенизировали в среде выделения 0,1 фосфатный буфер рН=7,6 содержащий 0,35 М NaCl. К 3 3 мл гомогената добавляли 2 мл 0,5 % -ной ТБК в 20 % трихлоруксусной кислоты инкубировали на кипящей водяной бане 30 минут, фильтровали и регистрировали оптическую плотность фильтрата на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 532 нм. Контролем служила среда выделения с реагентом.

Концентрацию  МДА рассчитывают в мкМ/г сырой  массы листьев по молярной экстинкции ε = 1,56 *10^-5 М^-1см^-1

 

2.4 Определение активности каталазы 

Для определения активности каталазы (Н₂0₂:Н₂0₂ - оксидоредуктазы, КФ 1.11.1.6) 1г листовой ткани растирают с 10мл 50мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Гомогенат фильтруют и центрифугируют 10 мин при 8000g. К 2,9мл фосфатного буфера приливают 25мкд полученного ферментного экстракта и непосредственно перед измерением добавляют 90 мкл 3% перекиси водорода. Измеряют на СФ - 46 при длине волны 325 нм падение оптической плотности за 1мин, и активность рассчитывают в моль/г навески х мин с использованием коэффициента молярной экстинкции ε =  39,4 мМ^-1см^-

 

3 Результаты  исследований

 

3.1 Определение влияния высоких и низких температур на состояние мембран изучаемых объектов

 

Семена томата замачивают в.различных концентрациях препаратов Рибав-Экстра (10^-5 %,  10^-6 %,10^-7 %), 6-БАП (10^-7 %,  10^-8 %,10^-9 %), а также воде (контроль) в течение 16 часов, после чего высаживали по 10 шт. в сосуды с почвой емкостью 2 кг и выращивали до появления 3-го настоящего листа (фаза кущения): влажность воздуха - около 80%, продолжительность светового дня 12 часов. Рисунок 1

Рисунок 1 Количество проросших семян томата в зависимости от различных концентраций раствора

После достижения фазы 3-го настоящего листа сосуды с растениями помещали на 16 часов в условия  экстремальных температур: в холодильник при температуре 2°С и в термостат при температуре 43°С (температурный контроль в это время находился при комнатной температуре). По прошествии этого времени растения из неблагоприятных температур вновь переносили в оптимальные температурные условия. На 7 сутки после возврата в оптимальную температуру производили измерения ростовых параметров (длину корня, побега, количество листьев и их площадь), а также в высечках листьев анализировали интенсивность перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов.

 

4.1 Определение интенсивности ПОЛ

 

Важным фактором устойчивости растений к окислительному стрессу  является функционирование эффективной  многоуровневой антиоксидантной системы, включающей как высокомолекулярные, так и низкомолекулярные соединения [1, 3]. К последним относятся фенольные соединения, или полифенолы, являющиеся одними из наиболее распространенных в растительных клетках веществ вторичной природы [3-5] Известно, что многие из них обладают высокой антиоксидантной активностью, не уступающей таковой у аскорбата или a-токоферола [6, 7]. Однако вклад фенольных соединений в общую активность антиоксидантной системы изучен еще крайне мало. Предполагают, что они способны инактивировать свободные радикалы, а также могут выступать в качестве субстратов для пероксидаз, таким образом защищая растения от АФК [8, 9].

Интенсивность ПОЛ определяли в первых листьях проростков томата по накоплению продукта окисления - малонового диальдегида (МДА), определяемого по цветной реакции с тиобарбитуровой  кислотой (ТБК) (Таблица и Рисунок 2), после воздействия экстремальных температур.

Таблица 1 Определения  содержания малонового диальдегида

Название раствора	Концентрация
	10-5	10-6	10-7	10-8	10-9	10-10	0
Ривав-экстра	4,9	3,5	2,8	-	-	-	-
6-БАП	-	-	-	3,3	4,15	5,2	-
Контроль	-	-	-	-	-	-	2,0

 

Рисунок 2 Изменение показателей  ПОЛ в зависимости от концентрации  препарата

 

Как видно на рисунке 2 предобработки семян кукуруза препаратом 6-Бап в степени 10^-10 имело наибольшее значение МДА, по сравнению с препаратом Рибав-экстра и контролем. Таким образом, можно сказать, что препарат 6-Бап в степени 10^-10 стимулировало процесс ПОЛ

 

4.2 Определение активности каталазы

 

Каталаза (КФ. 1.11.6) относится  к ферментам, которые наиболее длительно  сохраняют активность, почти не требуют энергии активации, скорость реакции этого фермента лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру. Главной функцией фермента является предотвращение накопления перекиси водорода, образующейся при дисмутации супероксидного аниона и при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов. Перекись водорода также образуется в клетках при действии некоторых окислительных ферментов. Помимо перекиси водорода каталаза разлагает также, но более медленно, метилпероксид и этилпероксид, Кроме того, в присутствии перекиси водорода каталаза окисляет низкомолекулярные спирты, а также нитриты. Таким образом, по скорости ферментативной реакции каталаза является более мощным ферментом в природе [25].

 

Таблица 2 Определения  активности каталазы

Название раствора	Концентрация
	10-5	10-6	10-7	10-8	10-9	10-10	0
Ривав-экстра	15,5	14,1	13,7	-	-	-	-
6-БАП	-	-	-	18,9	20,5	23,7	-
Контроль	-	-	-	-	-	-	16,0

 

Рисунок 3 Определения  активности каталазы

 

Как видно из таблицы 2 и на рисунке 3 предобработка проростков томата препаратом 6-БАП в условиях перекисного окисления липидов стимулировало антиоксидантную активность фермента каталазы. И максимальное значение активность каталазы имела в степени 6-БАП 10^-10.

 

 

 

 

Заключение

 

К числу ответных реакций  растений на действия разнообразных  природных факторов в частности  температуры, относится процесс  активации перекисного окисления  липидов.

Под влиянием температуры  в растениях происходит неконтролируемое усиление генерации АФК. Вследствие этого в клетках возникает окислительный стресс.Физиологические концентрации АФК не только не токсичны, но и необходимы для поддержания функций клеток. В клетках существует динамическое равновесие между образованием АФК и их ликвидацией, которое осуществляется с помощью многокомпонентной системы антиоксидантной защиты.

АО представляют собой соединения различной химической природы (витамин Е, коэнзим Q, глутатион, аскорбат), а также специализированные ферментные системы (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза глутатионтрансфераза, аскорбатпероксидаза и др.), способные тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических веществ.

Нами было установлено, что действие экстремальных температур стимулировали процесс перекисного  окисления липидов тканей проростков кукурузы. И установили, что предобработки семян кукуруза препаратом 6-Бап в степени 10^-10 усиливало процесс ПОЛ

Предобработка проростков кукурузы препаратом 6-БАП в условиях перекисного окисления липидов  стимулировало антиоксидантную активность фермента каталазы. И максимальное значение активность каталазы имела в степени 6-БАП 10^-10.

 

 

 

Список используемой литературы