Шпаргалка по "Гендік инженерия"

Ұзындығы әдетте 9-ға жуық нгуклеотидтерге тең келетін екінші тізбек инициациясына дейін  -35 негіздердей арақашықтықта  орналасады және де прокариот промоторларының көпшілігінде кездеседі. -35 пен -10  бөлімшелерінің аралығындағы сегменттің нуклеотидтік  тізбегі қауіпті болып есептелмейді, мәселен тек сол бөлімшелердің арақашықтығында -35 тізбегі РНҚ- полимераза ферментін  байланыструға қатысады, ал ол Прибнов-бокске қарай ферменттің жылжуына  ықпал етеді.

Алғашқыда құрамынды σ-фактор бар  инициацияның РНҚ-полимеразалық комплексі  ұзындығы 75-80 нуклеотидтерден тұратын  ДНҚ бөлімшесімен байланысады.  РНҚ –полимераза ашық полимеразалық комплекс түзе отырып спиральдың локальды  түрде тарқатылуына мүмкіндік береді, бұл процесс  Прибнов бокстен басталып  РНҚ түзілуінің инициациясы үшін жағдай туғызады. Осымен бір мезгілде  -10 жағдайындағы нуклеотидтер  маңайындағы ДНҚ қос шиыршығының екі иірімі (ұзындығы 17нуклеотидтер жұбы) толығымен тарқатылады.

σ-фактор  диссоциацияланған кезде өзіндік  РНҚ-полимераза  -30жағдайына қысқарады да  элонгация комплексіне айналады. Элонгацияның бұл комплексі -35тен -55 нуклеотидтер жұбына дейінгі шамадағы ДНҚ мен байланысады, ал фермент бірнеше жұп нуклеотидтерге жылжығаннан кейін  ол  бұрынғыдан да  жинақы бола түседі және ұзындығы 30-40 нуклеотидтер жұбынан тұратын ДНҚ бөлімшесімен  байланысады.

ϼ-фактор – бұл екі доменді олигомерлі белок.: біреуі РНҚ мен басқасы  АТФ пен  байланысады. РНҚ түзілуінің инициациясы сияқты терминация да реттелуші процесс болып табылады. Антитерминатор қызметін атқаратын белоктар да болады, олар ϼ-тәуелсіз терминаторларда терминацияны болғызбайды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. Индуцибельді  лактозалық оперон мысалында  прокариоттардағы транскрипция  белсенділігінің негативті және  позитивті реттелу процессін  түсіндіріңіз

Промоторлар – геннің РНК-полимераза ферменті танитын реттегіш ауданы. Промоторлардың екі түрі болады:

1. Конструктитивті гендердің үздіксіз экспрессиялануын қамтамасыз етеді;

2. Индуцебильді қоршаған орта факторларына тәуелді экспрессияланады. Мысалы: лактоза оперонының промоторы. Мұндай промоторларды реттелетін промоторлар деп те атайды. Гендік инженерияда гендердің экспрессиясын оптимизациялау мақсатында реттелетін промоторларды ғана пайдаланады.

Көп қолданылатын промоторлар:

1. Лактоза опейронының  промоторы (lac-промотор) – реттелетін  промотор. Ортаның құрамында лактозаның  бар-жоғына тәуелді:

i-индуктор изопропилтиогалактозид  репрессорды өзіне байланыстырып, оның оператор ауданымен байланысын  тежейді. Соның нәтижесінде синтез жүреді.

R –тек бос күйінде ғана оператормен байланысады.

цАМФ + САР (catabolite activator protein) комплексі – РНК-полимеразаның промотормен туыстығын арттырады.

 

 

6. Репрессибельді  триптофан опероны негізінде  транскрипциның аттенуациялану  механизіміне түсініктеме беріңіз 

Триптофан опейронының промоторы (trp-промотор) – триптофан амин қышқылының синтезіне жауапты. Ортада триптофан амин қышқылының бар-жоғына тәуелді.

Егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болмаса, онда синтез жүреді. Ал егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болса, онда синтез жүрмейді. Бұл жерде триптофан корепрессор қызметін атқарады.

Репрессоры өзі өзі оператормен байланыса алмайды, оған  coR керек. Оны триптофан атқарады. Егер триптофан болса тежейді. Сонда триптофан синтезі тоқтап қалады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. Реттелгіш промоторлар: lac-, trp-, tac-,  pL-  және T7. Олардың сипаттамасын  беріңіз

Промоторлар – геннің РНК-полимераза ферменті танитын реттегіш ауданы. Промоторлардың екі түрі болады:

1. Конструктитивті гендердің үздіксіз экспрессиялануын қамтамасыз етеді;

2. Индуцебильді қоршаған орта факторларына тәуелді экспрессияланады. Мысалы: лактоза оперонының промоторы. Мұндай промоторларды реттелетін промоторлар деп те атайды. Гендік инженерияда гендердің экспрессиясын оптимизациялау мақсатында реттелетін промоторларды ғана пайдаланады.

Көп қолданылатын промоторлар:

1. Лактоза опейронының  промоторы (lac-промотор) – реттелетін  промотор. Ортаның құрамында лактозаның  бар-жоғына тәуелді:

i-индуктор изопропилтиогалактозид  репрессорды өзіне байланыстырып, оның оператор ауданымен байланысын  тежейді. Соның нәтижесінде синтез жүреді.

R –тек бос күйінде ғана оператормен байланысады.

цАМФ + САР (catabolite activator protein) комплексі – РНК-полимеразаның промотормен туыстығын арттырады.

2. Триптофан опейронының  промоторы (trp-промотор) – триптофан  амин қышқылының синтезіне жауапты. Ортада триптофан амин қышқылының  бар-жоғына тәуелді.

Егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болмаса, онда синтез жүреді. Ал егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болса, онда синтез жүрмейді. Бұл жерде триптофан корепрессор қызметін атқарады.

Репрессоры өзі өзі оператормен байланыса алмайды, оған  coR керек. Оны триптофан атқарады. Егер триптофан болса тежейді. Сонда триптофан синтезі тоқтап қалады.

3. tac-промоторы – лактоза опейроны мен триптофан опейронының промоторларының гибриді.

tac-промоторының артықшылығы: екі түрлі индукторлармен реттеуге  болады:

Біріншісі – изопропилтиогалактозид (ИПТГ), ал екіншісі – триптофан амин қышқылы.

4. PL- промотор – λ-бактериофагының промоторы. cI репрессорымен реттеледі. PL- промоторының . cI репрессорының гені компитентті клеткалардың геномында болады.

сІ-репрессор – 28-300С-та активті, яғни синтез жүрмейді. Оператормен байланысып, геннің экспрессиялануын тежейді. Ал егер температураны 40-420С болса, сІ-репрессор денатурацияға ұшырайды да, өзінің активтілігін жоғалтады. Сөйтіп, оператормен байланыса алмайды, соның нәтижесінде синтез жүреді.

5. Т4 бактериофагының 10-шы генінің промоторы

6. Т7 бактериофагының промоторы. Ең адал промотор, ол тек қана Т7 бактериофагының РНК-полимеразасымен ғана байланысады.

 

8.Эукариоттар  мен прокариоттар генетикалық ақпаратының ұйымдасуы мен жүзеге асуыныдағы ерекшеліктерді салыстырып сипаттаңыз

Эукариоттар гендері. Эукариоттар гендерінің прокариоттардан айырмашылығы  олардың құрылымдық-функциональдық бірлестігі үзілмелі  болып келеді. Эукариотты организмдердің гендері  белгілі бір ретпен кезектесіп келетін, кодталатын бөлімдер – экзондар және кодталмайтын – кірме тізбектер немесе интрондардан  тұрады. Гендегі интрондар саны 2-ден бірнеше ондықтарға  дейін болады. Кейде геннің жалпы ұзындығының 40%-дейін интрондардың үлесіне тиеді. Осындай үзілмелі гендердің кодтаушы тізбектерінен функционалдық генетикалық элемент алынуы үшін кодталмайтын бөлімдер алыстатылып, ал кодталатындар – бір-бірімен қосылуы керек.

Интрондардың мөлшері, саны және орналасатын орны әртүрлі гендерде түрліше болады. Интрондар жеке кодондар аралығында немесе кодондардың өз ішінде болуы мүмкін. Әдетте интрондардың генге шаққандағы саны белокты кодтайтын тізбектің ұзындығына сәйкес артып отырады, ал экзондардың мөлшері орта есеппен 300 жұп нуклеотидтер шамасында болады. Жалпы алғанда интрон тізбектерінің ұзындығы экзондар ұзындығының жиынтығынан екіден он есеге дейін, кейде тіпті одан да көбірек артып кетеді. Үзілмелі геннің алғашқы транскриптінде генге тиісті нуклеотидтік тізбектің бәрі де болады. Одан әрі қарай интрондардың алынып қалуы про-мРНҚ пісіп жетілуі кезінде жүзеге асады, соның барысында экзондар сплайсинг (ағылшынша to splice - өру, өсіру) жолымен ковалентті байланыс арқылы мРНҚ молекулаларына қосылады.

рРНҚ және тРНҚ молекулаларын кодтайтын гендерде интронды кірме тізбектер болуы мүмкін, бірақ бұл гендерде олар сирек кездеседі. тРНҚ гендерінде интрондар антикодондардың ілгегіне жанасады.

Эукариоттардың генетикалық құрылымының бір ерекшелігі оларда саны бірден бірнеше мыңға дейін жететін, қайталанып келіп отыратын гендердің болатындығы.  Мысалы, рРНҚ-ның 18S және 28S гендерінің орналасуы жалпы алғанда барлық эукариоттарда бірдей рРНҚ-ның 18S, 5,8S және 28S гендеріндегі басты тізбек, сол сияқты транскрипцияланатын және транскрипцияланбайтын спейсерлердің ұзындығы жүздеген рет қайталанатын, шамамен 11 мың нуклеотидтер жұбын құрайды. Транскрипцияланбайтын спейсерлердің ұзындығы шамамен  ашыту бактерияларында 1750 нуклеотидтер жұбына тең болса, тышқандарда  олар 30000 нуклеотидтер жұбына тең  келеді.

Гендердің кластерлі құрылымы туралы да мысалдар бар. Адам геномында гемоглобиннің гендері екі кластермен араласады: бүкіл a - тәріздес гендер 16 хромосомада, ал b- тәріздес гендер 11 хромосомада жинақталған. Дрозофиланың гистонды гендері кластерінің жалпы ұзындығы шамамен 500 м.ж.н. (әрқайсысында 5 геннен болатын шамамен 5 м.ж.н. 100 рет қайталанатын бірліктер).

Әртүрлі организмнің геномдарынан сол сияқты хромосоманың бір жерінен екінші жеріне ауысып отыратын мобильді гендер де табылған. Жақында эукариоттардың геномдарында псевдогендер (жалған гендер) деп аталатын, кәдімгі құрылымдық гендерге ұқсас, бірақ белсенді полипептидтерге трансляцияланбайтын тізбектің болатындығы анықталды.

Жалпы қабылданған ереже бойынша транскрипция солдан оңға қарай жүреді, сол себептен бұл суретте геннің басы сол жақта, ал соңы оң жақта көрсетілген.

Ал, Ген – ДНҚ-ның кез-келген ауданы емес, яғни ДНҚ-ның промотор мен терминатормен шектелген ауданы немесе белок, фермент, рибонуклеин қышқылы туралы ақпарат жазылған ауданы.

Гендерді транскриптон немесе транскрип бірлігі деп атайды.

Прокариоттарда гендер полигендромды немесе полицистронды болып келеді. Генде бір немесе бірнеше ақпарат жазылған.

Кез-келген ген екі бөліктен тұрады:

Реттегіш бөлім – транскрипцияланбайды;

Структуралық бөлім – белоктар жайлы ақпарат жазылған бөлім.

Прокариоттарда реттегіш бөлімге промотор мен терминатор жатады. Қандай да болсын промотор де структуралық тізбектер бар.

Терминатор ауданы транскрипция процесінің тежелетін ауданы болып табылады.

Прокариоттардың гендері опейрондық деңгейде ұйымдасқан, яғни бір генде кездейсоқ белок емес, белгілі бір каталитикалық процеске қатысы бар белок туралы ақпарат жазылған.

Промоторлы аймақ  , ТАТА тізбек  (Прибнов бокс) транскрипцияның  белоктық факторлары. 

Промоторлы сайттардың құрылымына талдау жүргізу промотордың қызметінде шешуші роль атқаатын екі консервативті бөлімнің табылуына мүмкіндік берді:-35орналасу реті, -10орналасу реті.

Прокариоттар гендерінің көптегент промоторларың  құрамында универсалды 5’-ТАТА-3’ тізбегі болады, ол бастау нүктесінің алдында шамамен 10 нуклеотидтен тұратындай қашықтықта (-10) орналасады және РНҚ-полимеразамен танылып ажыратылады.  Оларды тұңғыш рет 1975жылы Д.Прибнов Т7 бактериофагының  екі генінің промоторынан  тапқан болатын. Сондықтан бұл тізбектер Прибнов тізбектері(Прибнов-бокс) немесе ТАТА тізбектері д.а.

Ұзындығы әдетте 9-ға жуық нгуклеотидтерге тең келетін екінші тізбек инициациясына дейін  -35 негіздердей арақашықтықта  орналасады және де прокариот промоторларының көпшілігінде кездеседі. -35 пен -10  бөлімшелерінің аралығындағы сегменттің нуклеотидтік  тізбегі қауіпті болып есептелмейді, мәселен тек сол бөлімшелердің арақашықтығында -35 тізбегі РНҚ- полимераза ферментін  байланыструға қатысады, ал ол Прибнов-бокске қарай ферменттің жылжуына  ықпал етеді.

Алғашқыда құрамынды σ-фактор бар  инициацияның РНҚ-полимеразалық комплексі  ұзындығы 75-80 нуклеотидтерден тұратын  ДНҚ бөлімшесімен байланысады.  РНҚ –полимераза ашық полимеразалық комплекс түзе отырып спиральдың локальды  түрде тарқатылуына мүмкіндік береді, бұл процесс  Прибнов бокстен басталып  РНҚ түзілуінің инициациясы үшін жағдай туғызады. Осымен бір мезгілде  -10 жағдайындағы нуклеотидтер  маңайындағы ДНҚ қос шиыршығының екі иірімі (ұзындығы 17нуклеотидтер жұбы) толығымен тарқатылады.

σ-фактор  диссоциацияланған кезде өзіндік  РНҚ-полимераза  -30жағдайына қысқарады да  элонгация комплексіне айналады. Элонгацияның бұл комплексі -35тен -55 нуклеотидтер жұбына дейінгі шамадағы ДНҚ мен байланысады, ал фермент бірнеше жұп нуклеотидтерге жылжығаннан кейін  ол  бұрынғыдан да  жинақы бола түседі және ұзындығы 30-40 нуклеотидтер жұбынан тұратын ДНҚ бөлімшесімен  байланысады.

ϼ-фактор – бұл екі доменді олигомерлі белок.: біреуі РНҚ мен басқасы  АТФ пен  байланысады. РНҚ түзілуінің инициациясы сияқты терминация да реттелуші процесс болып табылады. Антитерминатор қызметін атқаратын белоктар да болады, олар ϼ-тәуелсіз терминаторларда терминацияны болғызбайды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

9. Гендік инженерияда  кеңінен қолданылатын ферменттер  және олардың сипаттамасын беріңіз

Гендік инженерияда кеңінен қолданылатын ферменттерге:

1. ДНҚ- полимераза,

2. ДНҚ-лигаза,

3. полинуклеотидкиназа,

4. терминальды трансфераза,

5. рестриктаза,

6. кері транскриптаза,

7. сілтілі фосфатаза,

8. поли-(А)-полимераза.

ДНҚ-полимеразаны ең алғаш рет 1958 жылы Корнберг бөліп алған. ДНҚ-полимеразаның үш трі бар. Олар ДНҚ pol I, ДНҚ pol II, ДНҚ pol III. ДНҚ pol I- қос тізбекті сақиналы ДНҚ молекуласымен байланыспайды. ДНҚ pol I- қос спиральды ДНҚ-ның бір тізбегімен ғана байланысады. Оның 3 ферменттік активтілігі бар:

1. 5`¾>3` полимеразалық;

2. 3`¾>5` экзонуклеазалық;

3. 5`¾>3 экзонуклеазалық. `

 

ДНҚ pol I және III- репликацияға, ал ДНҚ pol II- репарацияға қатысады.

3`¾>5` экзонуклеазалық активтілік қате байланысқан аудандармен қоса 10 нуклеотидті кеседі.

5`¾> 3` экзонуклеазалық активтілік ДНҚ фрагментінің бір тізбегі немесе қос тізбегіндегі қате байланысқан аудандытаниды да, бір нуклеотидтің орнын ауыстырады.

ДНҚ-лигаза 1967 жылы Мезельсон тапты. Ол ДНҚ фрагменттерін тігеді. Фосфодиэфирлі нуклеин қышқылдарының қостізбекті молекуласындағы байланыстың синтезін катализдейді. Лигазалар ДНҚ репарациясы мен  репликациясына қажет. Гендік инженерияда ДНҚ-лигазаның екі түрі қолданылады. Оларды кофакторы және қызметіне қарай ажыратылады. Кофактор ретінде НАДН пайдаланылады