Шпаргалка по "Гендік инженерия"

Қосжарнақты өсімдіктерге агробактериялардың ауру жұқтыруы табиғатта кең таралған. Практикада in vitro жағдайында жүргізіледі. Өсімдіктерге бөтен ген енгізу арқылы  пайда болған жаңа қасиеттер Мендель заңдары бойынша тұрақты тұқым қуалайды. Вирулентік агробактерияларды  протопласттармен бірге өсіргенде  трансформация  өту үшін клетка қабығы қайта құрылуы қажет. Бұл құбылыс клетка қабығының  түзілуін тежейтін заттарды  қолдану және бактериялардың протопластарға қосылуын тежейтін ЭДТА қолдану арқылы дәлелденген.

Протопластарды бактериялардың сферопластымен(қабығы жоқ) бірге өсіру.

Қызғылт қабыршөптің протопластары агробактериялардың  октопиндік Ті плазмидасы бар  сферопластымен ПЭГ және поливинил спиртінің көмегімен қосылған. Одан кейін протопластар гормоны жоқ ортаға көшірілген. Өсіп шыққан клетка колонияларында  октопиннің түзілетіндігі  анықталған,  яғни клетка хромасомасының құрамында Т-ДНҚ болғандығы дәлелденген.

Протопластарға  ПЭГ  және Са2+ көмегімен Т-ДНҚ –ны тікелей енгізу тәжірибелері жасалған.Трансформацияланған клеткалар гормоны жоқ ортада өсіріліп сұрыпталған.

 ДНҚ  протопластарға  тасымалданғанда оны қорғау үшін  ДНҚ-ны липосомаларға (фосфолипидтердің шар тәрізді жасанды денешіктері) салады, әйтпесе клеткадағы нуклеаза ферменттері оны ыдыратып жібереді. Протопластар фюзоген көмегімен  липосомалармен оңай қосылады немесе эндоцитоз арқылы ішіне сіңеді.

Канамицинге төзімділік гені бар плазмида  теріс заряды бар липосомаларға салынып ПЭГ көмегімен  темекінің мезофильдік протопластарымен қосылған. Канамицинге төзімді клеткалардан трансформацияланған регенерант өсімдіктер алынған. Бұл әдістің артықшылығы, арнайы  ДНҚ молекуласын құрастырудың қажеті жоқ, ал кемшілігі  - трансформациялау жиі өтпейді.

Электропорация – клетка мембранасын электр тогымен тесу. Көбінесе жоғары кернеуі бар (1-2кВ/см) өте қысқа мерзімде  (10-3сек)  өтетін разрядты қолданады. Электропорация әдісімен гендер тасымалдану нәтижесін 1-2тәуліктен кейін байқауға болады.

Микроинъекция – өсімдік клеткаларына ДНҚ ерітіндісін құ№ үшін сыртқы диаметрі 2мкм инелер мен арнаулы микроманипулятор қолданылады. Әр протопластқа инъекция жасалатын  ДНҚ ерітіндісінің көлемі 10-8 – 10-9мл болады. Темекінің жапырақ мезофилінің протопластарына канамицинге төзімділік гені бар плазмидалар инъекция арқылы енгізілген.содан кейін протопластар 0,5-1мм  микроколлониялар болып көбейгенше әдеттегі ортада өсіріледі.кейін канамиці бар ортаға көшіріледі. Алынған төзімді клеткалар геномында енгізілген бөтен ДНҚ фрагменттері болғандығы блот-гибридизация арқылы анықталды.

Баллистикалық әдіс – алтын немесе вольфрам микробөліктерінің (0,4-1,2 мкм) бетіне кальцийді, полиэтиленгликольді пайдаланып ДНҚ-ны қондырады,кейін сол микробөліктермен  арнайы қондырғы арқылы өсімдік клеткаларын атқылайды. Металл бөліктері 300-600м/с жылдамдығымен клетка қабығын және мембраналарды тесіп өтеді. Реципиент ретінде әртүрлі ұлпалар қолданылады.

Липосомаларға қаптау. Экзогенді генетикалық материалды рестриктазалардың ыдырату әсерінен қорғау мақсатында липосомаларға қаптау әдісі қолданылады.

Липосомалар – фосфолипидтерден тұратын сфера тәрізді қабық. Фосфолипидтердің сулы эмульсиясын ультрадыбыспен өңдеу арқылы немесе сулы ерітінді мен липидтерді шайқау арқылы алады. Фосфатидилсерин мен холестериннен тұратын липосомаларды өсімдіктер мен жануарлар клеткаларына рекомбинантты ДНК-ны енгізу мақсатында қолданады. Гендерді липосомаларға қаптау арқылы тасымалдау әдісінің токсинділігі төмен.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

34. Жануарлар гендік  инженериясы және трансгенді  жануарлардың  биотехнологиялық қолданылуына түсініктеме беріңіз

Трансгенді жануарлар деп- геномында бөгде организм ДНҚ-сы бар жануарларды айтады.

Трансгенді жануарларды алу трансгеноз әдісімен жүзеге асады. Яғни, Басқа геномға белгілі бір геномнан алынған немесе жасанды түрде құралған гендерді экспериментальді тасымалдау – трансгеноз деп аталады. Геномына бөгде гендер енгізілген жануарлар трансгенді деп аталады.

Трансгенді жануарларды алу принциптері:

Жұмыртқа жасушасына трансгенді енгізеді;Инокуляцияланған жұмыртқа жасушасын  Реципиент аналық организмнің жатырына енгізеді;Реципиент- аналық организмде жалған жүктілікті шақырады. Ол үшін аналықорганизмді вазоэлектрленген (спермасы жоқ) аталықпен шағылыстырады.

Эмбрионда трансгеннің бар жоқтығын талдап, трансгені бар ұрпақтарды өзара шағылыстырып таза линияларды алады.

Трансгенді жануарлардың қолданылуы

Трансгенді жануарларды модельді объект ретінде;Рак ауруының пайда болу механизмін зерттеу ғылыми жұмыстарында; Муковисцидоз ауруының пайда болу механизмін зерттеу ғылыми жұмыстарында;Альцгеймер ауруының пайда болу механизмін зерттеу ғылыми жұмыстарында; Трансгенді құстар жұмыртқа белогында  тері қатерлі ісік ауруының  бір түрі  «меланома» клеткаларын жоятын mir24 протеин-антиденелер бар.

Адамның қанынан бөлінетін биологиялық белсенді белоктарын (гормондар, и ұю факторлары т.б.) трансгенді жануарлардың сүтінен бөліп алған ыңғайлы.

Американдық эксперттер Трансгенді ешкі сүтінен алынған өмірге қаупті тромбтардың пайда болуының алдын алатын  антитромбин белогы препаратының эффективтілігі мен қауіпсіздігін мойындады.

Трансгенді  тышқандарға вирусты немесе клеткалық онкогендерді енгізіп   канцерогенезді зерттеу мақсатында қолданылады.

Трансгенді қояндардың сүтінен алынған белоктар көмегімен лейкемия мен Миокард инфарктына қарсы препараттар алуға болады.

Мамандардың айтуынша, трансгенді ауыршаруашылық малдары – ХХІ ғ. Тірі биотехнологиялық фабрикасы болуы керек, олар экологиялық жағынан ең таза, құнды белок препараттарын өндіретін негізгі көзі болуы тиіс.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

35. Эмбриональді  бағаналы клеткалар (Плюропотентті)  және  микроинъекция әдістемесі негізінде трансгенді жануарлар алу процеесін түсіндіріңіз 

Трансгенді жануарлар деп- геномында бөгде организм ДНҚ-сы бар жануарларды айтады.

Трансгенді жануарларды алу трансгеноз әдісімен жүзеге асады. Яғни, Басқа геномға белгілі бір геномнан алынған немесе жасанды түрде құралған гендерді экспериментальді тасымалдау – трансгеноз деп аталады. Геномына бөгде гендер енгізілген жануарлар трансгенді деп аталады.

Трансгенді жануарларды алу принциптері:

Жұмыртқа жасушасына трансгенді енгізеді;Инокуляцияланған жұмыртқа жасушасын  Реципиент аналық организмнің жатырына енгізеді;Реципиент- аналық организмде жалған жүктілікті шақырады. Ол үшін аналықорганизмді вазоэлектрленген (спермасы жоқ) аталықпен шағылыстырады.

Эмбрионда трансгеннің бар жоқтығын талдап, трансгені бар ұрпақтарды өзара шағылыстырып таза линияларды алады

Микроинъекция әдісі

Ең алдымен буаз биенің сарысуын енгізеді, ал 48 сағаттан кейін адамның гонадотропинін. Нәтижесінде, гиперовуляция қалыпты жағдайда 5-10 жұмыртқа жасушасының орнына 35  жұмыртқа жасушасы пайда болады. Жұмыртқа жолы арқылы ұрықтанған жұмыртқа жасушасын жуу керек.

Сүтқоректілердің сперматозоиды жұмыртқа жасушасына енгеннен кейін оның ядросы (аталық пронуклеусы) жұмыртқа жасушасы ядросынан бөлек тіршілік етеді. Содан соңғы митоздық бөліну аяқталады және ол аналық пронуклеуске айналып, ядроның құйылысуы жүзеге асады. Аталық пронуклеус аналық пронуклеуске қарағанда үлкенірек болып келеді, оны секционды микроскоп көмегімен бөтен ДНҚ-ға оңай локализдеуге болады.

ДНҚ-ға 25-тен 40-қа дейінгі жұмыртқа жасушасын ендіргеннен кейін, микрохирургиялық жолмен «суррогатты»  ананы алады, вазэктомирленген аталықпен шағылыстырып, жалған жүктілікті тудырады.

Бағаналы клеткалар көмегімен трансгенді жануарлар алу

Тышқан эмбриондарының бластоциста даму кезеңінде бөліп алған клеткалар in vitro жағдайында кез-келген клеткаларға бастама болады. Сондай-ақ сондай типті клеткалар өзінің басқа клеткаларға бастама бола алу қасиетін бластоциста кезеңіндегі басқа эмбрионға енгізетін болса өзінің қасиетін өзгертпей сақтай алады. Мұндай клеткаларды плюрипотентті эмбриональды бағаналы клеткалар (ES) деп атайды.

ES-клеткаларды культурада  гендік инженериялық әдістерді  пайдалана отырып олардың плюрипотенттілігін  бұзбай отырып манипуляция жүргізуге  болады.

Мысалы, геномындағы мағынасыз сайттың орнына трансгенді енгізуге болады. Содан кейін генетикалық материалы өзгертілген клеткаларды таңдап алып, in vitro жағдайында культивирлеу арқылы трансгенді жануарлар алуда қолдануға болады.

Эмбриональды бағаналы клеткаларды пайдалана отырып трансгенді жануарлар алу микроинъекция және ретровирустарды қолдану әдістерінен айырмашылығы гендердің кездейсоқ орналасуын болдырмауға мүмкіндік береді.

 

 

 

 

 

 

36. Ретровирустар  негізіндегі векторлар мен ядролық  алмасу әдісімен трансгенді жануарларды  алу әдістеріне сипаттама беріңіз

Аналық-рецепиентке енгізу алдында эмбрионның дамуының алғашқы кезеңдерінде ұрықтарды ретровирустық векторлармен инфекциялау арқылы;Ұрықтанған жұмыртқа жасушасының спермийдің үлкен ядросына (аталық пронуклеус) микроинъекциялау арқылы;

Гендік модификацияланған эмбриональды бағаналы клеткаларды енгізу арқылы.

Ретровирустық векторларды қолдану ,.

Артықшылықтары:

Патогенді емес;

Қожайын клетка геномына интегрирленеді;

Жұмыс істеу оңай, манипуляция жүргізу қарапайым болып келеді;

Биологиясы жақсы зерттелген.

Кемшілігі:

Вирустық титры төмен;

Трансгенді енгізу сыйымдылығы шектеулі болып келеді: шамамен алғанда 10 мың жұп нулеотид;

Бөлінбейтін клеткаларды зақымдамайды (инфекцияламайды);

In vivo жағдайында терапиялық  мақсатта қолдануға қолайсыз;

Гендердің экспрессиялануы ұзаққа созылмайды.

Ретровирустық векторлар трансгенді жануарлармен жұмыс жасағанда қолданылады.

Ретровирустық векторлардың генетикалық ақпаратты тасымалдау сыйымдылығы үлкен емес, шамамен 9 мың жұп нуклеотидке дейінгі ДНК кесіндісін тасымалдай алады.

Вектор 3,5 мың жұп нуклеотидке дейінгі ДНК кесіндісін тасымалдай алады. Көптеген терапевтік кДНК мен ісік ауруларының супрессорлары гендерінің ұзындығы – 0,5–2 мың жұп нуклеотидті құрайды.

Ретровирустық вектор құрастырылғаннан соң, ретровирус геномына трансгенді енгізіп, онымен аналық жұмыртқа клеткасын инфекциялаймыз. Содан сон жасанды ұрықтану шақырамыз. Пайда болған ұрпақтардың құйрықтарының ұшын кесіп алып, оның геномына ПТР әдісін жүргізу арқылы трансгеннің бар-жоғын анықтаймыз.

Трансгенді жануар алудың ядро алмастыру әдісі.

Бұл әдіс қойларға жасалады және осы әдіс көмегімен ең алғаш атақты Долли қйы алынған. Бұл әдіс соматикалық клетканың ядросын алып, оны жыныс клеткасының,яғни аналық жұмыртка  клеткасына салуға негізделген. Соматикалық клетканың ядросын аналық жұмыртқа  клеткасына салған соң ол клетканы рецепиент қойдың жатырына салады. Осы әдіс көмегімен трансгенді қой алынды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

37. Трансгенді  жануар клеткасына енгізудің  гомологиялық рекомбинацияға негізделген  әдісі. Негативті және позитивті  селекцияға сипаттама беріңіз 

Бұл әдісті жүзеге асыру үшін арнайы вектор дайындалады. Ол вектордың құрамына мына компоненттер кіреді:

1. НВ1 және НВ2 (гомологты аудан)
2. Трансген
3. NeoR гені (G-418-ге тұрақтылықты қамтамасыз ететін ген)
4. tk1 және tk2 (тимидинкиназаның түзілуіне жауапты ген)

Бұл векторды клеткаға енгізудің спецификалық және спецификалық емес әдістері бар.

Спецификалық әдіс кезінде векторды клетка геномына НВ1 және НВ2 гомологты аудандары бойынша рекомбинациялайды. Ол кезде геномға tk1 және tk2 (тимидинкиназаның түзілуіне жауапты ген) гендері енбей қалады.

Ал спецификалық емес әдіс кезінде вектор клетка геномына баска тыс жатқан гомологты аудан арқылы рекомбинацияланады, ол кезде клетка геномына tk1 және tk2 (тимидинкиназаның түзілуіне жауапты ген) гендері де еніп кетеді.

Егер ортаға G-418-ді қосатын болсақ онда екі әдіс бойынша рекомбинацияланған клетка да тірі қалады. Ал егер ортаға ганцикловир қосатын болса , онда тек спецификалық әдіс арқалы рекомбинацияланған клеткалар ғана тірі қалады. Ал спецификалық емес рекомбинацияланған клеткалар өліп қалады, себебі тимидинкиназа мен ганцикловир қосылып улы қосылысқа айналады. Сол себепті клеткалар өліп қалады.

Ал тимидинкиназа гені енбеген, яғни спецификалық әдіс арқылы рекомбинацияланған клеткалар тірі қалады. Демек тек дұрыс рекомбинацияланған клеткалар ғана тірі қалады.

Бұл әдістер позитивті және негативті селекция деп аталады.

38. Гендік терапия: ex vivo, in vivo.   Оның негізгі принциптерін  түсіндіріңіз

Гендік терапия бұл тұқым құалайтын ауруларды емдеу максатымен адамның сомалық клеткаларындағы генетикалық материялдарды өзгертүге бағытталған гендік инженериялық және медедциналық әдістердің жиынтығы. Бұл мутациялар әсерінең ДНҚ молекуласындағы өзгерістерді жөндеуге немесе жасушадағы жаңа қызмет бере алатын қарқынды дамып келе жатқан жаңа бағыт. Медицинадағы геномика бұл  гендік терапия. Оның көмегімен көптеген тұқым құалайтын ауруларды емдеуге болады.

   ХХІ ғасырдың медицинасы  Гендік терапияның негзінде наномедициа  денгейіне жетті.Қатерлі ісік  артересклероз бен жұқпалы аурулардың  арасындағы  ЖИТС ауруының емделу.Гендік  терапия көмегімен шешілген.Қазіргі  заманда Гендік терапия Жыныс  клеткаларына емес тек соммалық  клеткаларға негізделген.

Гендік терапияның ex vivo \ағзадан тыс\ Бұл жағдайда геннін қалыпты көшірмесі науқастан бөліп алынған соммалық клеткаларға енгізіледі. Науқастын өзінің жасушасы алынғандықтан имундық жүйе бұндай клеткаларды бөлмей ыдыратпай қабылдайды.Жасушаға енгізілген қалыпты ген жетіспеген өнімді \ақуыз,фермент\ синтездейді. Бұл әдіс бойынша жеке жасушаның орнына ұқсас мерзім тіршілік ететін жасушалар жиынтығы бүкіл ағзамен біоігіп ,нысана ретінде пайдаланылады .Мысалы бағаналы клеткалар.