Шпаргалка по "Гендік инженерия"

1.Генді синтездеудің ферменттік (энзимдік) әдісі. Генді синтездеудің  үшінші әдісі кеңінен таралған  және кейін рекомбинанты ДНҚ  күйінде бір, кейде көп клеткалы  организмдерде көбейетін гендердің  негізгі шығу көзі болып саналады. Оның мәні   ферменттік синтез  арқылы   генді алудан тұрады  және төмендегіге саяды. Ең алдымен, клеткалардан (мұнда, қажет геннің  активтілігі жоғары болуы керек) информациялық (матрицалық) РНҚ (иРНҚ) молекулаларын бөліп алады, олардың арасында ген   коделейтін иРНҚ бар, міне осы иРНҚ-ны бөлу қажет. Бұдан  кейін кері транскриптаза (ревертаза) ферментінің көмегімен бөлінген   иРНҚ-да комплементарлы   ДНҚ (кДНҚ) синтезделеді. Кері транскрипция   процесінде матрицалық иРНҚ-да кДНҚ-ның синтезі басталуы үшін иРНҚ-ның 3'— ұшына комплементарлы «ашытқы,»-олигонуклеотид (қысқа тізбек) қажет. Жаңа кДНҚ тізбегі синтезделуі үшін тағы Мg иондары мен дезоксинуклеозидтрифосфаттар керек.

2.Жаңа кДНҚ синтезделіп  біткеннен кейін, оны тазалап, ДНҚ-ның  екінші тізбегін синтездеу үшін  матрица ретін де пайдаланады. Ол үшін ортаға ревертазаны немесе ДНҚ- -полимеразаны (бактериялардан алынған) қосады.   ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезі басталуы үшін олигонуклөотид (ДНҚ-ның 3'— ұшына комплементарлы) керек, әйтпесе кДНҚ-ның 3'— ұшы белгісіз себептермен шпилькалы кұрылым түзейді, осы құрылым екінші ДНҚ-ның синтезін инициациялай алады. ДНҚ-ының екінші тізбегі синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ-ымен қосылған бөлігі (шпилькалы) нуклеаза 51 ферментінің әсері арқылы ажырайды, нәтижесінде қос тізбекгі ген   алынады, оңы қос тізбекті комплементарлы ДНҚ (қт-кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің әсерімен гидролизденеді, ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның әсерімен ыдырайды.

Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бактерия клеткасына енгізбестен бұрын, оларға реттеуші элементтер жалғайды. Прокариоттарда сплайсинг өтпейтінін ескерсек, онда генді ферменттік жолмен синтездеу үшін матрица ретінде гяРНҚ-ны емес, жетіл-ген иРНҚ пайдалану керек.

19. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру әдістерін сипаттаңыз

1.Генетикалық инженерияның  негізгі мағынасы болып рекомбинантты  ДНҚ системасын құрастыру міндеті  саналады. Рекомбинатты ДНҚ деп in vitro жағдайында шығу көзі бойынша әр түрлі кез келген екі немесе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны түсінеді. Рекомбинантты ДНҚ-ның қарапайым құрамы бөтен ДНҚ мен вектордан тұрады.

Генетикалық инженерияның формалды тұрғыдан дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі, осы жылы II. Бэрг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмдердің — маймылдың рак вирусының, фагтың және бактериялық плазмиданың (вектордың)— ДНҚ  фрагменттерінен бірінші  рекомбинантты ДНҚ молекуласын  құрастырды. Дегенмен, бұл ДНҚ-ның клеткада жұмыс   істей алатындығы тексерілмеді, өйткені құрамында рак  вирусының гені болғандықтан П. Бэрг тәуекелге бармады. Дәл осы кезде

II. Лобан да осындай рекомбинантты ДНҚ молекуласын алу мүмкіндігін көрсетті. Бұл кезде рестриктазалар және оның қасиеттері ашылған болатын. 1973 ж.  С. Коэн және Г. Бойер плазмида негізінде векторларды құрастыру үшін рестриктазаларды пайдалану керектігін алғаш түсінді. Олар 1974 ж. клеткада кәдімгідей жұмыс істей алатын рекомбинантты ДНҚ молекуласын   құрастырды.

Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ құрастыру жолдары жаңа ғылыми дәйектермен  толтырылды және жетілді, ал олардың негізгі принциптері II. Лобан жәно С. Коэн ндеяларына сүйенеді.

2.Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың  ең кең таралған әдісі рестриктазаларды  қолдануға сүйенеді. Ол жабысқақ ұштар әдісі деп аталады.Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де (бөтен ДНҚ үзіндісі де) және векторда бір рестрикциялық ферменттің көмегімен үзіледі, нәтижесінде олардың ұштары бір-біріне  комплементарлы, яғни жабысқақ болғандықтан гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен оңай бірігеді. 'Жабысқақ ұштар әдісі өзі танитын ДНҚ бөлігін симметрия өсінен біршама қашықтықта үзетіп рестриктазаларға сүйенеді.

 Рекомбинантты ДНҚ-ны  жабысқақ ұштар әдісі бойынша  құрастырудың жақсы жақтары және  кемшіліктері бар. Алынған гибридтік  ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатын   бөліктердің қалпына келуі әдістің   жақсы жағын сипаттайды.Бұл бөтен ДНҚ фрагментін осы  рестриктазаның    әсерімен  салыстырмалы оңай бөліп алуға  мүмкіндік береді. Ал, рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің – жабысқақ ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияланып (қайтадан бірігуі) кетуі әдістің кемшілігін көрсетеді. Осының нәтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бөлігі ендірмелермен емес, өз ұштарымен тікелей әрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса бірнеше біріккен бөтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іріктеу жұмысын асыру керек.

 Бұдан басқа бұл  әдістің күрделілігі бар: рестриктаза  танитын нүктелер  эксперимент  үшін ыңғайлы  бөлікте орналаспауы  мүмкін, мысалы, олар қажет геннің  ішіне локализацияланады. ДНҚ-ның  кез келген ұшын плазмидамен рекомбинациялау үшін пайдалануға мүмкіндік туғызатын басқа әдістер де бар.

Гомополимерлі ұштар әдісінде немесе конекторлық симметрия өсімен үзетін рестриказа арқылы алынған ДНҚ фрагменттерінің «доғал» ұштарына (шығыңқы бір тізбекті бөлігі жоқ) терминалдық  трансфераза ферментінің көмегімен гомонуклеотидтер, мысалы ДНҚ-ның 3'— ұштарына поли (Т) немесе поли (Ц), ал векторлық ДНҚ-ның 3'— ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады. Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін (бетен ДНҚ және вектор) бір ортаға қосса, олар комплементарлы жұп негіздерін түзеп, оңай бір молекулаға бірігеді. Немесе ДНҚ фрагментіне де, вектордың ұшына да синтетикалық қос тізбек (линкер) жалғайды. Сонан соң линкерді танитын және оны жабысқақ етіп рестриктазамен үзеді. Осылайша бұл жолмен де жабысқақ ұштар алынады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың бұл әдісі Лобан-Берг идеясына сүйенеді.

Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі — доғал ұштарды жалғау (тігу). Оның, негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ-лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл әдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі тізбекті араларына ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл әдісті пайдалану өте ыңғайлы.

Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың қаралған үш әдісінің бірнеше модификациялары (өзгешеліктері) бар және де ген мен векторлық   молекуланың ерекшелігіне байланысты методологиясы әртүрлі болуы мүмкін.   Көпшілік жағдайда линкер технологиясы қолданылады.

20. Рекомбинантты ДНҚ-ны прокариот жуйелеріне трансформациялау әдістерін сипаттаңыз

 Рекомбинантты ДНҚ-ны прокариот жуйелеріне трансформациялау әдістері.

Трансформация –рекомбинантты ДНҚ-ны реципиент немесе қожайын клеткаға енгізу әдісі. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілдеріне: электропарация, жоғары температуралық шок және кальций тұздарымен өңдеу жатқызылады. Кальций тұздары негізіндегі трансформация бактерия клеткаларын өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындағына негізделген. Бөтен ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала кальций тұзымен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 10*4-10*5 плазмиданың біреуі ғана клекта ішіне енеді, яғни бактериялардың азғантай бөлігі ғана трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады. Әдетте, модификацияланған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метильденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жібереді. Ал клеткаға рекомбинантты ДНҚ-ның көп мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктазалары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар үзіп үлгермеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп –модификацияланып кетеді.

Клеткалық мембрананы электр тогымен қоздыру нәтижесінде рекомбинантты ДНҚ-ның клеткаға трансформациялану әдісі электропарация деп аталады. Электропарация барысында қожайын немесе реципиент клеткаға  ДНҚ-ны енгізеді, сосын оны кюветаға құйып, заряд жібереді. Одан  соң  2кВт элетр өрісі пайда болады. Электр өрісі пайда болған кезде жылдамдығы 4,5мс импульспен әсер ете отырып клеткалық мембрананы зақымдайды. Нәтижесінде пайда болған тесіктер арқылы рекомбинантты ДНҚ ішке енеді.

Ал температуралық шокпен әсер еткенде алдымен CaCl2 ерітіндісімен өңдейді де, содан барып рекомбинантты ДНҚ-ны енгізіп температураны бірден 42 ᵒС-қа көтергенде клеткалық мембранасы жыртылып, рДНҚ трасформацияланады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

21. Фенотиптік селекция көмегімен трансформацияланған клеткаларды анықтау. Селективті маркерлік және репортерлік гендерге сипаттама беріңіз

Трансформацияланған клеткаларды ажырату үшін маркерлік гендерді қолданады. Маркерлік гендердің екі түрі бар:

1. Селективті гендер;

2. Репортерлік гендер.

Селективті гендер клеткаға антибиотикке (канамицин, неомицин, тетрациклину) төзімділік белгісін, өсімдіктерде гербицидтерге төзімділікті береді. Мұндай селективті маркерлік гендердің жұмыс істеу принципі – трансформацияланған клеткалардың трансформацияланбаған клеткалардың өсуін тежейтін ингибиторлар қосылған арнайы селективті орталарда өсуіне негізделген.

Репортерлік гендер клеткаға зиян әсер етпейтін нейтральды белоктарды кодтайды, олардың мөлшері оңай анықталады. Визуалды көруге болады. Репортерлік гендер ретінде β-глюкуронидаза гені (GUS), жасыл флуоресценттік белок гені (GFP), люцифераза гені (LUG), т.б. пайдаланылады. Трансформацияланған өсімдіктерде селективті гендердің  орнына репортерлік гендерді пайдалану дұрыс, себебі олардың адам денсаулығына және қоршаған ортаға теріс әсері болмайды.

Қазіргі кезде репортерлі гендердің ішінде GUS және  GFP гені жиі, ал LUC және CAT гендері сирек қолданылады.

Глюкуронидаза (GUS). GUS- ті алғаш рет E. coli-ден бөліп алған. Оның активтілігін тіркеу оңай. рН пен температураға тәуелсіз болып келеді. Глюкуронидаза ферменті глюкуронид деген затты гидролиздейді. Субстраты – паранитрофенил β-глюкуронид.

Жасыл флуоресцентті белок (GFP – green fluorescent protein). Жасыл флюресцентті белокты ең алғаш рет Шимомура деген жапон ғалымының басшылығымен Aequorea victoria люминесцентті медузаларда болатындығын анықтаған. Жасыл флуоресцентті белоктың бар-жоғын анықтау оңай, оған субстраттың қажеті де жоқ. Ультракүлгін сәулесінде қараса, өз бойынан жарық шығарады.

Люцефераза (LUC) – люминисценциялаушы бактериялардан (светлички) бөлініп алынған. Көк спектрде флюресценцияланады. Оны көп қолданбайды, өйткені детергенттер мен температураға тұрақсыз. Трансформацияланған клеткалар өз бойынан жарық шығарады.

CAT гені – хлорамфениколацетилтрансфераза ферментін кодтайды. Оның активтілігін хромогендік субстрат көмегімен анықтайды. Алғаш рет Escherihia coli клеткасынан бөлініп алынған. Хлорамфениколацетилтрансфераза ферменті ацетил топты ацетил-КоА-дан хлорамфениколға тасымалдайды.

β-галактозидаза – бұл геннің активтілігін хромогендік субстрат көмегімен анықтайды (Х-gal). Паранитрофенил β-галактозид ортаны көк түске бояйды.

 

 

 

 

22. In situ жағдайында нуклеин қышқылдарының гибридизациясы (Саузерн және Нозерн блоттинг) әдісітеріне сипаттама және олардың гендік инженерияда қолданылу аясы

Трансформацияланған клеткаларды айқындау. Саузерн және Нозерн блотинг әдістері.

 Қажет   генді барлық   бактериялар массасынан   алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда   бактерияның әрбір жеке   клеткасы жеке ұрпақ береді   яғни бактериялық шоғыр түзіледі.

Енді гендер жинағын яғни  әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы   аз болған сайын одан қажет генді табу оңай.

Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы   әдістер қолданылады. Кең   тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады.

1. шоғырларды гибридизациялау 

Ол үшін   Петри    шынысындағы  негативтік   шоғырларға (рДНҚ-сы бар   бактериялар) нитроцеллюлозалы   сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады.

Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар   агарды бірнеше жерден   инемен шаншиды.

Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, нитроцеллюлозамен байланысады.

ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады.

Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі сүзгіні радиоактивті зондпен өңдеу.

 Зонд (сүңгі) дегеніміз  іздеп жатқан ген бөлігінің  азоттық негіздеріне комплементарлы  кішігірім ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Сүңгі әр уақытта радиоактивті изотоппен белгіленеді.

Сүңгіні синтездеу үшін геннің немесе белоктың ең болмағанда кішігірім бөлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек.

 Олардың амин қышқылдар  тізбегі бойынша және генетикалық  кодтың көмегімен геннің  бөлігін  кодтайтын нуклеотидтор тізбегін оңай алуға болады.

Алайда, кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, сондықтан белоктың белгілі тізбегінен метионин және триптофан амин қышқылдары (олардың бірден ғана кодондары бар) болатын бөліктерінен синтетикалық олигонуклеотид — синтезделеді.

Табиғи сүңгі ретінде қажет геннің функциясы қарқынды өтетіні белгілі клеткадан әр түрлі жолдар арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады.

Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі.

Сүңгі тек өзіне комплементарлы генмен ғана байланысады.

Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридизация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым көтеріңкі емес, өйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі өзінің ДНҚ-сын тауып үлгіруі үшін).