Шпаргалка по "Гендік инженерия"

трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады.

Әдетте, модификацияланбаған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метилденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жіберетінін біз білеміз.Ал, клеткаға рекомбинантты ДНҚ молекуласының көп  мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктаазлары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар кесіп үлгірмеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп — модификацияланып кетеді. Ғалымдар генетикалық инженерия тәжірибелерінде  рестрикциялық ферменттері жоқ бактериялық клеткаларды жиі қолданады. Мұндай рестрикцияланбайтын клеткаларда әдетте модификациялаушы ферменттер де жоқ болады.

2.Ген клонын  көбейту. Белгілі концентрациялы бактериялық суспензияны қатты ет-пептондық қоректік ортаға, мысалы, қосымша қоректік заттар бар агарга егеді, сонда Петри шыны ыдысының 1см2 бетіне 1—10 бактериялар келуі керек. Агардың үстіне түскен бактериялық клеткалар бөліне бастайды, соңында олардың әрқайсысының көптеген ұрпақтары сыртқы пішіні бойынша саңырауқұлақтың қалпақшасына ұқсас кішігірім шоғырлар түзейді. Әр шоғырда бастапқы бір бактериялық клеткадан түзілген және одан ешқандай айнымайтын көптеген клеткалар бар, оны клон деп атайды. Бастапқы суспензияның әрбір клеткасы да өз клонын түзейді (позитивтік колония).

Вектор ретінде бактериофагты қолданғанда генді бактерияға енгізу және соңғыны қоректік ортада өсіру жоғарыдағыдай  плазмидалық вектор қолданғандағыдай өтеді.Фаг ДНҚ-сы (енбеген  клеткалар агарда көбейіп, көмескі тегіс «газон» түзейді.   Ал, фаг ДНҚ-ы бар   бактериялар түскен орындарда мөлдір дөңгелек ойыстар түзіледі, оларды негативтік шоғыр деп атайды. Негативтік   шоғырдың түзілуі клеткада фаг ДНҚ-ның репликациялануына және жетілген  фагтардың пайда болуына   байланысты. Бұдан кейін фагтар басқа клеткаларға еніп, оларлы ыдыратады, нәтижесінде әрбір ойын бір ғана ДНҚ-сы клеткаға енген  ДНҚ-ның   копиясы бар фаг ұрпақтарынан тұрады.

 М13 фагы клетканы лизиске  әкелмегендіктен негативтік шоғыр  түзбейді. Бірақ олар көбейген  орындарда бактериялық клетканың  бөлінуі бәсеңдейді, сондықтан жалпы  көмескі  газонда мөлдірлеу ойыстар  пайда болады. Соңғы  газонда қажет  рДНҚ молекулалары енген     бактериофагтардың көбеюі өтеді.

Қазіргі кезде ген инженериясында ген  клонын көбейтудің екі әдісі кең қолданылуда: геномның жеке фрагментін (кДНҚ-ны қажет геннің иРНҚ молекуласынан кері транскрптаза ферменті көмегімен алу) және барлық геном клонын көбейту.

Комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) клонын көбейту әдісін организмнің қайсы клеткаларында кажет белок синтезделетінін білгенде ғана алуға болады. Оның үстіне белоктың синтезделуі анағұрлым көп мөлшерде өтуі керек, тек сонда ғана клеткада қажет белоктың иРНҚ-ның көшірмелері көп болады және осыған сәйкес көптеген негативтік шоғырларда іздеп отырған геннің 0 көшірмелері бар деп есептелінеді.

Бірқатар жағдайларда белок синтезделетін клеткаларды табу мүмкін болмайды, ал кейде қажет белоктың синтезделуі мардымсыз өтеді. Осыларға байланысты геномның қажет фрагментін (генін) синтездеу іске   аспайды, өйткені матрицалық иРНҚ-ны клеткадан бөлу өте қиынға соғады. Мұндай жағдайда ген клонын көбейтудің екінші — геномның барлық  ДНҚ-сының клонын көбейту әдісі колданылады.   Барлық   геномның   клондарын көбейту. (ДНҚ-ның жеке фрагментінің   клонын көбейтуге   қарама-қарсы) шотган-эксперимент (ағыл. shotgun — бытыра мылтық: бірнеше   бытыраның бірі нысанаға тиеді   яғни көптеген гендерден қажет біреуін сұрыптап алуға болады) деп аталады. Бұл әдістің мәні-кез келген организмнің   жоғары молекулалы ДНҚ-сын механикалық   түрде (мысалы гидродинамикалы  әдіспен немесе ультрадыбыстың әсерімен) немесе рестриктазалармен  әр түрлі фрагменттерге  ұсақтайды. Соңғы  кезде  рестриктазалар    жиі қолданылады. Мұнда кажет геннің құрылымы белгісіз болғандықтан, алдын    ала рестриктаза таңдау    мүмкін емес, сондықтан тәжірибеде бірнеше ерекше   рестриктазалар қолданылады және олардың бірі организмнің басқа гендерімен қатар қажет генді де үзе алады деп есептелінеді. Басқаша айтқанда бұл әдіс арқылы табиғи  генді бөліп алуға болады. Ары қарай бөлінген көптеген    әр түрлі ДНҚ фрагменттері векторларға жалғанады.   Міне,      осындай  организмнің барлық   геномын сипаттайтын.рДНҚ-лар жинақтамасы генотека немесе гендер жинағы деп аталады. Гендерді генотекада плазмидалық рДНҚ-түрінде (этил спиртінің тұнбасында), әсіресе рекомбинантты лямбда фаг суспензиясы түрінде (температурасы 0°С тең антисептиктер бар ортада) сақтау өте ыңғайлы. Басқа жағдайда рекомбинантты фагтарды бактериялар клондарында да сақтауға болады. Мұндай клондарды оқтын-оқтын жаңа қоректік орталарға ауыстыру қажет. Аталған жұмыстардың көмегімен кез келген организмнің гендер жинағын алуға болады. Бұл қызықтыратын жұмыстың қиындықтары көп, олардың түрлі зерттеушілер әр қилы әдістерді қолданып жеңуде. Қазір әлемнің жүздеген зертханаларында гендер жинағы құрастырылды. Гендер жинағы ғылыми эксперименттік жұмыстарда және биотехнологиялық бағытта қолдану тапты. Олар кез келген генді немесе бірден бірнеше генді бөліп алу көзі және молекулалық генетиканың әдістемелік құралының ажырамайтын бөлігі болып саналады.

Кері транскрипцияның ашылуы құрылымды гендердің жинағын құрастыруға мүмкіндік берді. Оларды гендерге сәйкестендіріп комплементарлы ДНҚ генотекасы деп атайды, өйткені кДНҚ ешуақытта қажет генге толық сәйкес келмейді, сонымен қатар онда қосымша тізбектер де бар.

Белгілі бір организмнің толық геномы клонын көбейту үшін қажет гендер жинағының мөлшерін   геномның-молекулалық массасы-(М)  мен фрагменттің орта мөлшерін біліп және   дәлдік деңгейді (Р) таңдап,   анықтауға болады:

N =M (n x 1n) -1-P

Қоянның барлық геномын сипаттайтын гендер жинағын құрастыру үшін жоғары дәлдік деңгейде 920 мың клондар қажет. Ген инженериясының классикалық объектісі — Е. Соlі бактериясының  гендер жинағын дайындау үшін анағұрлым аз клондар саны қажет-1,4 мың. Сүтқоректілердің геномы үшін ең долбарлы есеп бойынша 800 мың—1 млн. клондар санынан құралған гендер жинағы қажет.

Эукариоттық организмдердің гендер жинағын алу үшін олардың барлық ДНҚ жиынтығын гидродинамикалық әдіс арқылы фрагменттерге бөліп, вирустарға енгізеді.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

26. Сахоромицеттердің  геномының құрылысы мен гендік  инженерияда қолданылу артықшылықтарын  көрсетіңіз

1967 жылы Дж.Синклэйер авторлармен  жариялаған мақаласында ашытқы  ДНҚсы қос тізбекті, сақиналы  конторлы ұзындығы шамамен 2 мкм  болатыны жазылды. Көптеген зерттеулер S.cerevisiae осындай ДНҚ молекуласына  ие екені көрсетті. Бұл ДНҚ  молекуласы 2мкм плазмида кейіннен Scp1 деп аталды. Бір гаплоидты клеткаға  штамға байланысты 30-200 Sep1көшірмесінен  келеді. Қоймалжың тығыздық Sep1 цезий  хлоридінің концентрациясы хромосомалық  ДНҚ секілді.  Ашытқы клеткасындағы Sep1 функциясы қазірге анықталмаған. Себебі фенотипі жағынан қалыпты  ашытқы штамдарының кейбіреулерінде Sep1 болмайды. Соған байланысты, берілген  плазмида, клетка тіршілігіне маңызды  бөліктерін кодтамайды.  S.cerevisiae штамында Sep1 плазмидасы болса cir+ деп атауды, ал болмаған жағдайда cir0 деп атау ұсынылған. Scp1 молекуласының ашытқы ядросында орналасқандығын әртүрлі әдістермен анықтаған, бірақ ашытқы хромосомасындағы ДНҚда Scp1 молекуласының интегрелденген көшірмесін алу сәтті болмаған.

Қазіргі кезде ашытқы сахаромициттер негізінде көптеген экспрессияланушы векторлар құрастырылған. Көбінесе олар YЕp- типті плазмидалар болып табылады. Оларда күшті промотор, осы промотор бақылауында ген эквивалентті енгізуге арналған уникальды рестрикционды сайт,   сонымен қатар синтезделетін гибридті мРНҚ дұрыс 3̀ соңы қалыптасу үшін қандай да бір ашытқы генінің  қалыптасу үшін қандай да бір ашытқы генінің 3 соңының бөлімі бар. Көбінесе S.cerevisiae нің  гликолитикалық ферменттері генінің промоторын қолданады.

 

 

 

 

27. Ашытқы клеткаларына  бөгде генді енгізу мақсатында  қолданылатын векторлар: эписомалық, интегральді және клондаушы векторлар (YIp, YEp, YRp) YAC хромосомаға сипаттама  беріңіз

Ашытқы клеткаларына бөгде генді тасымалдау үшін эписомалды векторлар, интегралды векторлар және жасанды хромосомалық векторлар қолданылады.

Эписомалды векторлар-құрамында 2 микрондық плазмидасы бар векторлар. Ол геномдық ДНҚ-ға тәуелсіз автономды репликацияланады.

Интегралды векторлар-экспрессилауға кажетті генді хромосомаға енгізуге арналған. Ол автономды репликацияланбайды, тек хромосома екі еселеніп көбейгенде ғана хромосомамен бірге көбейіп отырады. Ол хромосомаға тәуелді болады.

Ашытқы жүйесіндегі жасанды хромосомалар ҮАС ДНҚның үлкен фрагменттерін клондауға арналған. Мысалы  100м.ж.н.астам ДНҚ кесіндісін клондауға арналған. Кейін олар ашытқы клеткасында жеке хромосома ретінде орналасады. ҮАС векторының жүйесі өте тұрақты болып келеді. Оның көмегімен адамның ДНҚ геномының физикалық картасын және транскриптондардың үлкен анализін жүргізген, адамның индивидуалдық ДНҚ хромосомасы бар геномдық библиотекаларды құрастырған. ҮАС векторы хромосомаға өте ұқсас болып келеді, өйткені алу құралы ДНҚ репликациясының инициациясының бастаушы тізбек сайты, ашытқы хомосомасының центромерліауданының сегменті және теломерлер қызметін атқарушы тізбектер болады. Теломерлер хромосоманың тұрақтылығына жауапты.

Бөтен ДНҚны ҮАС векторға енгізген кезде маркерлік  гендерінің оқылу аясында ауытқулар болады. Соның нәтижесінде арнайы қоректік ортада клеткалар өсіргенде сол геннің белоктық өнімі түзілмейді. Ортада түрлі-түсті реакцияларды байқаймыз.

Кейбір ҮАС векторлардың құрамында клондау сайттарынан тәуелсіз селективті маркерлер болады. Айтарлықтай айырмашылықтарына қарамастан өндірістік деңгейде белоктардың синтезі үшін пайдаланбаған, қолданбаған

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

27.Ашытқы жүйесі. 2мкм плазмидасы негізіндегі экспрессиялаушы векторлар.

Эукариоттар ген инженериясында қарапайым эукариоттарды сипааттайтын барлық қасиеттер бар: цитоплазмадан ядро қабығы арқылы оқшауланған ядросы бар және ДНҚ –ның репликация,транскрипция және трансяцияның ферменттік аппараты (оның ішнде сплайсинг ферменттері) басқа эукарйттардағыдай. Ашытқылармен генетикалық жұмыс жүргізу өте женіл бактериялар сияқты сұйық орта өсе алады, қатты ортада шоғыр түзеді, тіпті парафин, метил спирті сияқты субстраттарда да тез көбейе алады. Бұдан басқа ашытқылар геномының мөлшері үлкен емес -1,7*107 нуклеотитті жұп. Ең бастысы ашытқылар генетикалық тұрғыдан жақсы зерттелген. Ашытқы жүйесіндегі векторлар YІp интеграциялаушы векторлар. YЕp эписомалдық векторлар. YRp репликациялаушы векторлар т.б 

Интегратциялаушы векторлар. ORI  ауданы болмайды және өздері репликациялана алмайды. Хромосомаға интегратцияланады. Ашытқыларда гомологиялық рекомбинатция өте жақсы жүреді, сондықтан да интеграция жүру үшін гомология аудандары қажет. Ашытқы жүйесіндегі жасанды хромосоммалар.Ашытқы жүйесіндегі  хромосомалар ДНҚ үлкен фрагменттерін тасымалдауға қабілетті, бірақ оның эффективтілігін өзгеруі өте төмен.

 

 

 

          3 AOX

amp HiS4

tgapdp

 

          ori    5 Aox

Эписомалық вектор 2мкм плазмидадан Ori ауданынан тұрады. Осы Ori ауданмен автономды репликацияланады. Бұлар REP3 гені болады. REP3 генінде oriфуданымен плазмида болуы керек. Себебі трансактивті REP1 мен REP2 генднрі УЕР кездеспеуі мүмкін, себебі онда ori ауданы мен плазмида болады. 2 мкм ашытқы плазмидасы ашытқылардын көп көшірмелері циклді плазмидалары.Репликация генін REP1 REP2 сайт спесификалық рекомбиназаны FLP кодтайды,амплификация локусынан және плазмиданын бөлінуіне жауапты локустардан \STB\ тұрады.

Эписомды плазмиданың негізінде шатр –векторлар жасалады.Ori аудан, селективті маркерлер, промотордан тұрады. Ашытқы жүйесіндегі эписомалық векторлар. Ашытқы ДНҚ ның негізнде бірнеше векторлық молекулалардын типтері құрастырылды. Оларды ДНҚ фрагменттерін алуан ұзындығын көбейтү үшін пайдаланды.

 

                 2 м

     Amp                   Leu 2

 

                               РБАГВК

              Ori E    2m

2m 2микрон, Leu 2 амин қышқылдарын  қамтамасыз етеді.

Yrp- репликатциялану ARS аймағынаң  басталады. Олар табиғаты жағыннан Ori  ауданы ұқсас осы тізбектер 2 микронды плпзмиданын бөлшегі  болады. Олар кем дегенде 60 жұп  нуклеотидттен тұрады. А мен  Т  жұбымен байытылған. Ол ашытқыларда TRP1 және ARU4 хромосомалардын осы локустарында  жақын орналасқан.

 

 

28. Ашытқы клеткаларын  трансформациялау әдістерін көрсетіңіз

Ашытқы клеткаларын трансформациялаудың 3 түрлі әдісі бар.

1. Экзогенді ДНҚ молекуласын  алдын ала химиялық және энзимологиялық  жолмен клетка қабықшасынан ажыратылған  клеткаларына (протопластарға) енгізу.

2. Бөгде ДНҚ молекуласын  енгізбестен бұрын литий ацетатымен өңдейді.

3. Электропорация көмегімен енгізу

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

29. Бакуловирустар  геномының кұрылысы және вирус  геномы негізінде эукариот гендерінің  жоғары экспрессиясын қамтамасыз  ететін векторларға сипаттама  беріңіз

Бакуловирус-омыртқасыздарды инфекциялайтын вирус. Геномы- сақиналы қос тізбекті ДНҚ. Мөлшері 88-160 мың н.ж. Бұл вирус инфекциялағаннан кейін 30-52 сағат аралығында көбейеді, инфекциялағаннан кейін 5 тәуліктен кейін сыртқа шығады. Оның вироидтары полиэдрон қабығымен қапталып тұрады.Оның ұзындығы 250-400 нм, диаметрі 50-100 нм. Полиэдрон қабаты полиэдрин белогынан тұрады.

Бакуловирус геномы негізінде бөгде генді клондау үшін Аутофагия калифорния (AcMNP) штамы қоданылады.

 

 

Осы штамннан тасымалдаушы вектор жасаймыз. Оның құрамында  5’-AcMNP және 3’-AcMNP гомологты ауданы, полиэдринді синтездеуші геннің промотері, қажетті ген, терминатор және селективті маркерлік ген болады.