Биотехнология в молочном скотоводстве

При введении инструмента  в цервикальный канал сперму следует  впрыскивать медленным нажатием на поршень катетера, распределяя  ее равномерно на протяжении всего  канала шейки матки. Допускается  легкий массаж шейки и рогов матки. Для большинства животных мясного  скота характерен легковозбудимый  тип нервной деятельности. Поэтому, при искусственном осеменении следует  создавать спокойную обстановку с целью снятия стрессового воздействия  на животное. В случае если донор  ведет себя неспокойно, проводят внутримышечную инъекцию 2%-го аминазина из расчета 0,05 г на 100 кг живой массы. После осеменения коров-доноров необходимо выдержать в стойле до прекращения признаков охоты.

Искусственное осеменение коров-доноров  в суперовулирующую охоту является одним из важных факторов, который оказывает влияние на оплодотворяемость яйцеклеток и выход полноценных эмбрионов. Поэтому в этот период за донорами должен вестись строгий контроль для того чтобы четко определить начало охоты и ее продолжительность. Нашими исследованиями было установлено, что кратность осеменения оказывает положительное влияние на эмбриопродуктивность коров-доноров (табл. 3). Оплодотворяемость яйцеклеток при трехкратном осеменении, при этом увеличивается на 6,0%, а выход полноценных зародышей, в расчете на одного донора на – 1,2 эмбриона.

Таблица 3

Оплодотворяемость яйцеклеток, количество и качество эмбрионов у коров-доноров в зависимости от кратности их осеменения.

7.Контроль реакции яичников

Контроль реакции яичников проводится с целью определения  готовности донора к извлечению эмбрионов, а также для ориентировочного определения возможного количества эмбрионов, что дает возможность  вести контроль за качеством извлечения и планировать дальнейшую работу. Подсчет желтых тел и фолликулов у доноров проводят непосредственно перед извлечением эмбрионов путем ректальной пальпации яичников. При этом следует учитывать, что полноценное желтое тело представляет собой бугорок грибовидной формы с углублением в центре и твердый на ощупь. Фолликулы не так резко выступают над яичником, округлые по форме. При пальпации чувствуется флуктуация фолликулярной жидкости. У доноров, у которых желтые тела отсутствуют или их насчитывается не более двух, извлечение эмбрионов не проводят.

Техника нехирургического извлечения эмбрионов включает предварительную  оценку половых органов донора (наличие  и подсчет желтых тел на каждом из яичников, определение состояния  матки и размеров ее рогов). Эмбрионы извлекают на 7-й день после осеменения суперовулирующих доноров. Перед извлечением эмбрионов животное фиксируют в станке, прямую кишку освобождают от фекальных масс. Наружные половые органы и перинеальную область тщательно моют теплой водой с мылом, осушают салфеткой, а затем дезинфицируют специальными аэрозолями. Эпидурально вводят 5-7 мл 2%-го раствора новокаина для предотвращения акта дефекации и снятия напряжения гладкой мускулатуры прямой кишки. Строптивым коровам вводят внутримышечно 10-15 мл аминазина с целью снятия стресса.

В качестве промывной жидкости используется фосфатно-буферный раствор (среда Дюльбекко) в объеме 1000 мл.

После введения катетера промывная  среда в рог матки подается порциями (по 50-60 см³). После ее подачи рог матки поднимают за верхушку, осторожно оттягивают вдоль брюшной полости и слегка массажируют. В этот период промывная среда через отверстие в катетере поступает внутрь его и самотеком попадает в стерильный цилиндр для сбора жидкости. Эту процедуру выполняют 8-10 раз. Обычно на промывание одного рога матки нужно 500 мл среды. Процесс извлечения эмбрионов контролируется ректально.

Для извлечения эмбрионов  используется два вида инструментов: двухканальные катетеры фирмы “Нойштадт” (Германия) и трехканальные фирмы “Кассу” (Франция).

Для работы в условиях фермы  Белорусским НИИ животноводства предложена закрытая система извлечения эмбрионов на основе двухканальных  инструментов (табл. 4).

Таблица 4

Результаты извлечения эмбрионов  в зависимости от используемого инструмента.

Закрытая система извлечения эмбрионов нехирургическим методом  на основе двухканального катетера позволяет  изолировать промывную среду  от воздуха помещения. Вследствие этого  уменьшается бактериальная обсемененность среды, увеличивается производительность труда, сокращается время на извлечение эмбрионов. При использовании данной системы выход эмбрионов от числа  желтых тел увеличивается на 14,3% по сравнению с применением катетера фирмы “Нойштадт” и на 11,8% при работе с трехканальным катетером фирмы “Кассу”.

8.Оценка качества эмбрионов, их кратковременное культивирование.

Оценку биологической  полноценности эмбрионов крупного рогатого скота можно проводить  несколькими методами: морфологически, с использованием фитальных красителей, культивированием. Наибольшее распространение получил морфологический метод. Установлено, что результаты имплантации зародышей зависят от того, насколько полно оценена их жизнеспособность. Работу с эмбрионами проводят в стерильных условиях в специальном помещении - боксе при температуре воздуха + 22 - +25°С.

Основными критериями, по которым  производится оценка качества эмбрионов, являются: определение стадии их развития, соответствие уровня дробления возрасту от оплодотворения до извлечения, целостность  и форма оболочки, размеры бластомеров  и связь между ними. Биологически полноценными считаются эмбрионы, имеющие  правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, прозрачную неповрежденную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом. Пригодные к пересадке эмбрионы на 7-8-й день после осеменения соответствуют  стадиям развития: ранняя и поздняя  морула, ранняя и поздняя бластоциста. Для ранней морулы характерно наличие 16-32 бластомеров. Бластомеры разной величины, набухшие, перивителлиновое пространство свободно от отдельных бластомеров. У поздней морулы число бластомеров увеличивается до 32-64. Краевые бластомеры равной величины, завершено уплотнение между бластомерами, отсутствуют разрывы связей между ними.

Для ранней бластоцисты характерно наличие 64-130 бластомеров. На этой стадии образуются трофобласт и бластополость. Перивителлиновое пространство еще различается. Поздняя бластоциста имеет более 130 бластомеров с четко выраженной бластополостью. Эмбриобласт локализирован и отчетливо виден. Трофобласт непрерывный. Зона пеллюцида утончена. Перивителлиновое пространство отсутствует.

Эмбрионы с асинхронным  дроблением, с бластомерами разной величины, с повреждением прозрачной оболочки, с лизисом бластомеров  и нарушением связи между ними, а также с агглютинацией (разрушением) цитоплазмы, множественными включениями  в перивителлиновом пространстве не пригодны для трансплантации. Для неоплодотворенной яйцеклетки характерна однородность клеточной массы, округлая форма, отсутствие бластомеров.

Для морфологической оценки качества морул и бластоцист рекомендуется 5-ти бальная шкала: отличные - эмбрионы сферической формы, стадия развития соответствует возрасту, зародышевые клетки однородные по размеру и цвету; хорошие - эмбрионы соответствуют стадии развития, но имеются небольшие отклонения: неправильная форма, наличие незначительных включений в перивителлиновом пространства, выделение одного или нескольких бластомеров, увеличение перивителлинового пространства; удовлетворительные - эмбрионы имеют клетки со структурными отклонениями, деформированные бластомеры, в перивителлиновом пространстве мертвые клетки; условно-годные - эмбрионы с деформированной прозрачной оболочкой, частичным разрушением бластомеров, нарушением связи между ними, фрагментацией цитоплазмы, сжатием бластомеров; неудовлетворительные – эмбрионы, отстающие в развитии, со структурными нарушениями, имеющие клетки разного размера, дефекты прозрачной оболочки (сколы, трещины), содержат включения в перивителлиновом пространстве.

Манипуляции с эмбрионами с момента их получения до пересадки  или криоконсервирования занимают от одного до семи часов. В течение этого времени необходимо создать условия, обеспечивающие сохранение жизнеспособности эмбрионов. Кроме того, продолжение развития зародышей при кратковременном культивировании является дополнительным тестом в их морфологической оценке.

Культивирование эмбрионов  проводят в часовых стеклах в 0,5-1,0 мл культуральной среды, помещенных в чашки Петри, в термостате при +37°С во влажной атмосфере и при постоянном составе газовой среды (90% азота, 5% кислорода и 5% углекислого газа). После чего их оценивают на пригодность к пересадке. Эмбрионы, пригодные к эмбриопересадке, помещают в специальные пайетты с помощью микроаспиратора по схеме: среда для культивирования (2,5-3,0 см) - воздушный пузырек - (0,5-0,7 см) - эмбрион со средой (2,0-3,0 см) - воздушный пузырек (0,5-0,7 см) - среда для культивирования (2,5-3,0 см). Пайетта готова для пересадки. Для транспортировки на большие расстояния свежеполученные эмбрионы заправляют в пайетты, помещают в специальный контейнер. В таком состоянии зародыши сохраняют жизнеспособность до 24 часов.

Нехирургическая пересадка  эмбрионов состоит в основном из трех этапов: подготовки реципиентов  к пересадке эмбрионов; пересадки, включающей прохождение с помощью  специальных катетеров внутренней полости половых органов от преддверия влагалища до верхушки рога матки; строгого контроля за реципиентом до установления стельности или до выявления охоты. Основным критерием эффективности применения метода трансплантации эмбрионов является их приживляемость после нехирургической пересадки. Этот показатель во многом зависит от качества самих эмбрионов, степени синхронности проявления эструса между донором и реципиентом, квалификации специалиста и условий выполнения работы по пересадке.

В работе для нехирургической  пересадки эмбрионов используют катетеры производства фирмы “Нойштадт” и “Кассу”.

Пересадка эмбрионов проводится в период диэструса (7-8-й день). В этот период матка наиболее восприимчива к инфекции. Поэтому при пересадке необходимо строго соблюдать асептику. У реципиента должно быть четко выраженное желтое тело, качество которого определяется непосредственно перед пересадкой и оценивается по трехбалльной шкале: "отличное", "хорошее", "удовлетворительное". Животные, у которых желтые тела отсутствуют или слабо выражены, исключают из числа реципиентов и используют в технологии искусственного осеменения.

Эмбрион, заправленный в  пайетту, помещают в стерильный катетер для пересадки, на который надевают полиэтиленовый санитарный чехол. Подготовленный таким образом к пересадке инструмент вводят во влагалище (под углом 45°) до шейки матки. Санитарный чехол прорывают катетером, под ректальным контролем катетер продвигают через цервикальный канал. После прохождения цервикального канала катетер вводят в рог матки, на стороне которого в яичнике имеется хорошо развитое, функционирующее желтое тело. Форма желтого тела должна быть округлой, с четко выраженной на верхушке ямкой в виде грибка. Катетер продвигают как можно ближе к верхушке рога матки, ректально контролируя положение округлой головной части инструмента. Убедившись в правильности расположения инструмента, специалист осторожно выдавливает содержимое пайетты в просвет рога матки. Извлекать катетер из полости матки реципиента необходимо осторожным движением.

Скорость пересадки эмбрионов  определяет показатель стельности. Поэтому  пересадку должны проводить быстро и осторожно. Оптимальное время  пересадки 1-2 мин.

Эффективность пересадки  эмбрионов повышается при использовании  препаратов (миорелаксантов), уменьшающих сокращения эндометрия при манипуляции с маткой (табл. 5).