Моніторинг показників якості та безпечності риби

За умови відсутності в посівах на диференціально-діагностичному середовищі характерних для бактерій роду Salmonella колоній, роблять висновок про відсутність бактерій роду Salmonella в досліджуваній наважці продукту.

За умови наявності хоча б на одному диференційно-діагностичному середовищі, характерних для бактерій роду Salmonella колоній, проводять їх подальше вивчення.

Біохімічне підтвердження того, що виділені характерні колонії відносяться до бактерій роду Salmonella.

Не менше, ніж три характерних колонії з кожного диференційно- діагностичного середовища бактеріологічною петлею пересівають на скошену поверхню поживного агару. Частину колоній пересівають штрихами по поверхні та уколом у стовпчик середовища трицукрового агару. Посіви інкубують 24 год. при температурі 370С.

З відібраних колоній для біохімічного підтвердження готують мазки та фарбують їх за Грамом.

До бактерій роду Salmonella відносяться грамнегативні палички з заокругленими кінцями.

Рухливість паличок визначають мікроскопуванням фазово-контрастним методом у роздавленій краплі.

Після інкубації посівів проводять опрацювання результатів ферментації лактози, глюкози та сахарози, утворення сірководню та розщеплення сечовини на трицукровому агарі:

• пожовтіння скошеної частини середовища вказує не ферментацію лактози, або сахарози, або обох цукрів;
• пожовтіння стовпчика середовища з розривом агару або пухирцями газу вказує на ферментацію глюкози з утворенням газу;
• пожовтіння стовпчика середовища без розривів або пухирців газу вказує на ферментацію глюкози без утворення газу;
• почорніння середовища у стовпчику від темної лінії вздовж уколу середовища до почорніння всього стовпчика вказує на утворення сірководню.

Типовим для бактерій роду Salmonella є культури, що ферментують глюкозу з утворенням або без утворення газу, не ферментуючі лактозу і сахарозу, що утворюють сірководень, та не розщеплюють сечовину.

Опрацювання результатів випробувань. Результати оцінюють за кожною пробою окремо. Штами, які показали типові біохімічні властивості та позитивні серологічні реакції з полівалентною аглютинуючою сальмонельозною сироваткою, відносять до сальмонел. Позитивні реакції аглютинації з О- та Н- сальмонельоз ними сироватками дозволяють встановити антигенну формулу виділеної культури, тобто її серологічний варіант.

Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocytogenes за ДСТУ / ISO 11290 – 1:2003 [43].

1. Первинне накопичення на селективному рідкому збагаченому середовищі зі зниженою концентрацією селективних агентів (половинний бульйон Фрезера)

Посів проводять на селективне первинно збагачене середовище що містить один об’єм літію хлориду та по половині об’єму акрілфлавінової та налідиксової кислот (половинний бульйон Фрезера). Інкубують досліджувані проби за температури 300С протягом 48 год.

2. Вторинне збагачення на селективному рідкому збагаченому середовищі з повною концентрацією селективних агентів (бульйон фрезера)

Інкубують бульйон фрезера за температури 370С 48 год.

3. Посів на чашках та ідентифікування

Отримані культури з половинного та повного бульйону фрезера, висівають на чашки на два селективні щільні середовища: Оксфорд агар, ПАЛКАМ агар. Інкубуєм за температури 300С 24  ̶ 48 год. та перевіряють на наявність характерних колоній. На Оксфорд агарі типові колонії матимуть невеликі розміри (1мм) сіруватого кольору, оточені чорними ареолами та западеним центром. На ПАЛКАМ  ̶ агарі лістерія росте у вигляді маленьких сіро-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи ̶ з чорним ареолом, але завжди з чорним ареолом навколо.

4. Підтвердження чистоти культури

Пересівають культури, попередньо віднесені до лістерій на триптон соєвий агар з екстрактом дріжджів таким чином, щоб добре відокремлені колонії могли розвиватися. Беруть відокремлені колонії та підтверджують відповідними морфологічними, фізіологічними та біохімічними випробуваннями належність їх до лістерій.

Реакція на каталазу. Ізольовані колонії розчиняють у краплі розчину пероксиду водню на предметному склі. Негайне утворення газових бульбашок свідчить про позитивну реакцію.

Фарбування за Грамом. Лістерії є грам позитивними тоненькими короткими паличками.

КАМП-тест. Засівають штрихуванням кожний штам Staphylococcus aureus та Rhodococcus equi на агар з баранячою кров’ю таким чином, щоб дані культури були паралельними та діаметрально протилежними. Засівають досліджувані штами таким чином, щоб випробувальні культури S.aureus та      R. equi не торкалися одна одної, але знаходились на найближчій відстані одна від одної (1  ̶ 2 мм.). Декілька штамів розміщують в рядок на одному середовищі. Одночасно засівають контрольні культури лістерій. Інкубують культури за температури 370С протягом 12  ̶ 18 год. Збільшену зону гемолізу під час пересікання з кожною з культур S.aureus та R.еqui вважають позитивною реакцією. Позитивна реакція з R.еqui проявляється у вигляді широкого (5  ̶ 10мм) «стрілоподібного» гемолізу. Реакцію вважають негативною, якщо маленькі зони слабкого гемолізу розширюються лише до 1 мм під час пересікання на випробувальних штамах з дифузійною зоною культури  R.еqui. Позитивна реакція з S.aureus проявляється у вигляді маленької зони збільшеного гемолізу, розширеного до 2 мм з випробовуваних штамів і в межах слабкої гемолізної зони через розростання культури S.aureus.

Відповідно до одержаних результатів зазначають дані про наявність чи відсутність Listeria monocytogenes.

Органолептичні дослідження проводили у відповідності до ГОСТ 7631-85 . Визначення свіжості проводили за наступними показниками.

1. Реакція на пероксидазу.

Хід роботи: 10 г м'яса + 40 мл дистильованої води. Настоюють протягом 30 хв, фільтрують через фільтрувальний папір. У пробірку вносять 2 мл витяжки. Додають 5 крапель 0,2%-ого спиртового розчину бензидину. Вміст пробірки струшують, після чого додають 1 %-ого розчину пероксиду водню.

Обробка результатів: рибу вважають свіжою, якщо витяжка набуває синьо- зеленого кольору, що переходить протягом 1  ̶ 2 хв у буро-коричневий (позитивна реакція). Рибу вважають несвіжою, якщо витяжка не має специфічного синьозеленого кольору або відразу з'являється бурокоричневий (негативна реакція).

2. Проба варки.

Хід роботи. Обробка результатів.

Доброякісна риба: бульйон світлий, аромат  ̶ специфічний, м'ясо добре

розділяється на окремі м'язові пучки.

Недоброякісна риба: бульйон мутний, запах риби та бульйону неприємний.

3. Визначення вмісту сірководню з підігріванням проби (табл. 2.2).

Таблиця 2.2 Визначення вмісту сірководню з підігріванням проби

Контроль	Проба
5- 7 г фаршу м'яса риби поміщаємо  у пробірку (рихло). Під пробку закріплюємо смужку фільтрувального паперу, змоченого дистильованою водою діаметр краплини не більше 5 мм.	5- 7 г фаршу м'яса риби поміщаємо  у пробірку (рихло). Під пробку закріплюємо смужку фільтрувального паперу, змоченого 10% розчином свинцю оцтовокислого діаметр краплини не більше 5 мм.

 

Підігріваємо на водяній бані при температурі 48  ̶ 52 °С, протягом 15 хв. Ведемо облік результатів відповідно до табл. 2.3.

Таблиця 2.3 Обробка результатів на вміст сірководню з підігріванням проби

	Контроль	Проба
Свіжа риба	Папір білий	Папір білий
Сумнівна риба	Папір білий	На папері слабо-бура пляма
Несвіжа риба	Папір білий	На папері від бурого до темно-коричневого пляма

4. Визначення концентрації водневих іонів.

5 г фаршу м'язів риби + 5мл дистильованої води. Настоюємо 30 хв, періодично помішуючи. Фільтруємо через паперовий фільтр. Фільтрат використовуємо для дослідження, для цього застосовуємо рН-метр.

Обробка результатів:

Свіжа риба: фільтрат злегка опалесціює, рН  ̶ до 6,9.

Сумнівна риба: фільтрат злегка мутний (рН  ̶ 7,0  ̶ 7,2).

Несвіжа риба: фільтрат мутний, запах неприємний рН  ̶ 7,3 і вище.

5. Визначення числа Неслера:

Хід роботи. Обробка результатів.

Свіжа риба: число Неслера ̶ до 1,0.

Сумнівна риба: число Неслера ̶ 1,2  ̶ 1,4.

Несвіжа риба: число Неслера ̶ 1,6  ̶ 2,4 більше.

6. Бактеріоскопія.

На предметних скельцях роблять два мазки-відбитки: перший з поверхневих шарів м’язів, другий  ̶ із м’язевої тканини глибоких шарів, розміщених біля хребта. Приготовлені препарати фарбують за Грамом. Під мікроскопом переглядають 10 полів зору і підраховують середню кількість мікроорганізмів в одному полі зору.

У мазках з поверхневих та глибоких шарів м’язів свіжої риби мікроорганізмів не має або виявляють поодинокі палички і коки в декількох полях зору. Препарат погано фарбується, на склі не помітні залишки розкладеної тканини.

У мазках із глибоких шарів м’язів риби сумнівної свіжості виявляють 10  ̶ 20, а з поверхневих 30  ̶  50 мікроорганізмів в одному полі зору. Препарат фарбується задовільно, на склі добре помітні волокна м’язових тканин, що розкладаються.

У мазках з глибоких шарів м’язів несвіжої риби виявляють 30  ̶  40, а з поверхневих 80  ̶ 100 і більше мікроорганізмів в одному полі зору (переважно паличковидних). Препарат добре фарбується, на склі  ̶ багато м’язевої тканини, що розклалась.

Органолептичні показники риби залежать від ступені її свіжості (табл. 2.4).

 

Таблиця 2.4 Органолептичні показники риби залежно від ступеня свіжості

Досліджуваний орган чи частина тіла	Доброякісна	Сумнівної свіжості	Недоброякісна
Слиз	Прозорий, без стороннього запаху	Мутний, липкий, з кислуватим запахом	Брудно-сірого кольору, липкий, з кислим або гнильним запахом
Луска	Гладенька, блискуча, важко висмикується	Матова, легко висмикується	Матова, самовільно випадає
Очі	Випуклі, чисті	Дещо запалі, рогівка мутна	Глибоко запалі, рогівка мутна
Рот	Закритий	Напіввідкритий	Відкритий
Зябра	Яскраво-червоні, слиз тягучий, прозорий, зяброві кришки туго прилягають	Світло-рожнві до слабко-сірого, слиз мутний, запах кислий, зяброві кришки напіввідкриті	Брудно-зеленого кольору, слиз мутний, запах гнилісний
Внутрішні органи	Черевце не здуте. Добре виділені внутрішні органи	Черевце здуте. Внутрішні органи жовтяничні. Нирки, печінка розм’ягчені	Черевце сильно здуте. Внутрішні органи погано виділені
М’язи	Пружні. Риба не згинається. М’ясо погано відділяється від кісток.	Дещо згинається. М’ясо легко відділяється від кісток і розділяється на окремі пучки	Риба легко згинається. М’язи тістоподібної консистенції, розпадається
Густина в воді	Тоне	Не тоне, при зануренні випливає.	Плаває на поверхні, частіше черевцем догори

 

Паразитологічне дослідження риби. Найбільш надійним методом є повний паразитологічний розтин, який дає можливість провести кількісний та якісний облік усіх гельмінтів, якими уражена риба. Повний паразитологічний розтин починається зі зважування та заміряння її довжини. Рибу розтинають над емальованою кюветою або на широкій гладенькій досці. Спочатку роблять короткий надріз в ділянці анального отвору. В надріз вводять тупий кінець ножиць і розрізають рибу вздовж по серединній лінії черевця. Розріз продовжують до кута нижньої щелепи. Потім роблять дугоподібний надріз, вирізають ліву черевну стінку, відділяють її, після чого порожнину тіла і внутрішні органи уважно оглядають.

Накладають лігатури на кишечник біля анального отвору і на стравохід в його початковому відділі, щоб не пошкодити травний тракт. Потім виймають внутрішні органи. Вирізають яєчники або сім’яники, поміщаючи їх в чашки Петрі і проглядають. Плавальний міхур оглядають ззовні а потім ̶  і з середини. Нирки, котрі лежать вздовж хребта, зіскоблюють тупим інструментом, збирають в чашки Петрі та досліджують компресорним методом. Вирізають та оглядають серце, роблячи, за необхідності, надрізи на ньому. Вмістиме, яке залишилося в середині збирають і досліджують компресорно. Спочатку відділяють печінку і досліджують її. Особливу увагу приділяють огляду жирової тканини, яка оточує шлунково-кишковий тракт та інші органи. 

Після огляду внутрішніх органів досліджують м’язи. З риби знімають шкіру і оглядають її внутрішній бік, а частину м’язів, які відділилися зі шкірою, розрізають на пластинки і ком пресують. М’язи досліджують повністю, розрізаючи їх в косому напрямку на пластинки, товщиною не більше 3  ̶  5 мм [45, 46].

 

2.2 Характеристика лабораторії

Хмельницька зональна спеціалізована державна лабораторія ветеринарної медицини з хвороб прісноводних риб і інших гідробіонтів, м. Хмельницький, вул. Космічна 1/1,  була створена в 2004 році у відповідності до наказу Державного департаменту ветеринарної медицини від 4 червня 2004 р. № 67.

Основні напрямки діяльності лабораторії.

Лабораторія організована відповідно до Закону України „Про ветеринарну медицину"; в своїй діяльності керується Конституцією України, іншими законами України, актами Президентами України, Державної ветеринарної та фітосанітарної служби Укроїни , Державного науково- дослідного інституту з лабораторної діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи, положенням про лабораторію.

Лабораторія є державною установою ветеринарної медицини з питань лабораторної діагностики хвороб риб.