Технология производства ферментов

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Оглавление

Введение.

1. Классификация ферментов.

2. Глубинный метод производства  ферментов.

3. Производство ферментов  при поверхностном культивировании  продуцентов.

4. Иммобилизация ферментов.

5. Классификация носителей  для ферментов.

6. Методы иммобилизации  ферментов.

7. Оборудование для производства  ферментов.

8. Применение иммобилизованных  ферментов.

9. Рынок ферментов и  ферментных препаратов.

10. Литература

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Органические отходы, как  правило, имеют вид макромолекул, размеры которых иногда больше размеров бактериальной клетки. Для использования  бактериями этих веществ, они должны подвергнуться расщеплению, либо гидролизу. Однако если вещество является трудно растворимым, процесс расщепления (гидролиза) может быть длительным. Ускорение  процесса достигается с помощью  ферментов, синтезируемых клетками микроорганизмов, и выделяемых во внешнюю  среду.

Название ферменты происходит от латинского «fermentum» - закваска. Ферменты представляют собой сложные белковые молекулы и являются «биологическими катализаторами». «Биологический» говорит о том, что они являются продуктом или производным какого-либо живого организма. Слово «катализатор» означает, что вещество, обладает способностью увеличивать скорость химической реакции, при этом само оно в результате реакции не изменяется. Следовательно, после завершения реакции фермент способен сразу же вступать в новую.

Ферменты характеризуются  субстратной специфичностью, то есть взаимодействуют только с одним  веществом, и специфичностью действия - катализируют одно из возможных превращений, которым может подвергаться это  вещество. Иными словами, фермент  является своеобразным «ключом», способным  открыть определенный «замок». В  качестве «замка» выступают крупные  органические молекулы, содержащиеся в сточных водах, которые расщепляются до веществ, необходимых микроорганизмам.

Ферменты ускоряют химические реакции, действуя в десятки, а иногда и сотни тысяч раз быстрее, чем неорганические катализаторы.

Многие вещества, используемые живыми организмами в качестве источников энергии, способны окисляться только при  очень высокой температуре. При  нормальных условиях эти реакции  либо не идут, либо протекают с очень  низкой скоростью. Небольшой пример: химическое окисление азота аммиака (содержащегося в больших количествах  в сточных водах и имеющего резкий неприятный запах) до свободного азота протекает при температуре 600-700 °С; ферментативное - при температуре окружающей среды. К другой особенности, отличающей ферменты от химических катализаторов, можно отнести способность регулировать скорость протекания реакции в зависимости от концентрации субстрата в окружающей среде (чем выше содержание вещества, тем быстрее происходит его разложение). Все это делает фементы незаменимым сырьем для практически любого вида производства, от пишивой до текстильной.

1. Классификация ферментов

Ферменты как биокатализаторы  обладают рядом уникальных свойств, например, таких как высокая каталитическая активность и избирательность действия. В ряде случаев ферменты обладают абсолютной специфичностью, катализируя  превращение только одного вещества. Для каждого фермента существует свой оптимум рН, при котором его каталитическое действие максимально. При резком изменении рН ферменты инактивируются из-за необратимой денатурации. Ускорение реакции при повышении температуры также лимитировано определенными пределами, поскольку уже при температуре 40-50оС многие ферменты денатурируют. Эти свойства ферментов приходится учитывать при разработке технологии нового препарата.

Поскольку ферменты - вещества белковой природы, в смеси с другими  белками их количество определить практически  невозможно. Наличие фермента в препарате  может быть установлено лишь по протеканию той реакции, которую катализирует фермент. При этом количественную оценку содержания фермента можно дать, определив  либо количество образовавшихся продуктов  реакции, либо количество израсходовавшегося субстрата. За единицу активности фермента принимают то его количество, которое  катализирует превращение одного микромоля субстрата в 1 минуту при заданных стандартных условиях - стандартная единица активности.

По решению Международного биохимического союза активность решено определять при t = 30оС по начальной скорости реакции, когда концентрация насыщения фермента и временная зависимость близка к кинетике реакции нулевого порядка. Остальные параметры реакции индивидуальны для каждого фермента. Активность ферментного препарата выражается в микромолях субстрата, прореагировавшего под действием 1 мл ферментного раствора или 1 грамма препарата в оптимальных условиях за 1 минуту. Если ферментный препарат не содержит балласта, то его активность выражается в тех же стандартных единицах на 1 мг фермента. Если же есть балласт, то активность считается на 1 мг белка в ферментном препарате. Активность выпускаемого препарата - важнейший нормируемый показатель качества.

Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом, составляют гидролазы. К ним относятся, в  первую очередь амилолитические ферменты: б-амилаза, в-амилаза, глюкоамилаза. Их основная функция - гидролиз крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе расщепляется на декстрины, а затем до глюкозы. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты образуют класс пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - на связь между аргинином и лизином. В промышленности протеолитические ферменты классифицируют по способности проявлять активность в определенной области рН:

рН 1.5 - 3.7 - кислые протеазы;

рН 6.5 - 7.5 - протеазы;

pH > 8.0 - щелочные протеазы.

Протеазы находят широчайшее применение в разных отраслях промышленности:

мясная - для смягчения  мяса;

кожевенная - смягчение шкур;

кинопроизводство - растворение  желатинового слоя при регенерации  пленок;

парфюмерная - добавки в зубную пасту, кремы, лосьоны;

производство моющих средств - добавки для удаления загрязнений  белковой природы;

медицина - при лечении  воспалительных процессов, тромбозов  и т.д.

Пектолитические ферменты уменьшают молекулярную массу и снижают вязкость пектиновых веществ. Пектиназы делятся на две группы - гидролазы и трансэлиминазы. Гидралазы отщепляют метильные остатки или разрывают гликозидные связи. Трансэлиминазы ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применяются в текстильной промышленности (вымачивание льна перед переработкой), в виноделии - осветление вин, а также при консервировании фруктовых соков.

Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется в деполимеризации молекул целлюлозы. Обычно используются в виде комплекса, доводящего гидролиз целлюлозы до глюкозы (в гидролизной промышленности). В медицинской промышленности их используют для выделения стероидов из растений, в пищевой - для улучшения качества растительных масел, в сельском хозяйстве - как добавки в комбикорма для жвачных животных.

Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В  первую очередь, к ним относится  генетический. Состав и количество синтезируемых ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены можно изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с ценными для промышленности свойствами. К мутагенным факторам относятся ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы, антибиотики, другие химические соединения, преобразующие наследственные элементы клетки. Несмотря на определяющую роль генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды. При этом важно не только наличие источников основных питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп. Механизм этого явления еще не вполне изучен, но сам факт должен учитываться при выборе технологии.

Рассмотрим несколько  примеров. Фермент липаза почти не синтезируется грибом Aspergillus awamori на среде без индуктора, добавление жира кашалота усиливает биосинтез фермента в сотни раз. При добавлении же в среду крахмала и при полном исключении минерального фосфора интенсивно синтезируется фосфатаза. Не только наличие индуктора способно увеличивать выход фермента. Важную роль играет состав питательной среды и условия культивирования. При разработке процесса биосинтеза a-амилазы культурой Aspergillus oryzae замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян злаковых) ещё в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов питательной среды на 50% - ещё в 2 раза.

Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов  добавляют различные факторы  роста, например, аминокислоты, пуриновые  основания и их производные, РНК  и продукты её гидролиза. В качестве источника углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут утилизировать и минеральные источники азота. В состав питательных сред входят и ионы MG, Mn, Zn, Fe, Cu и др. металлов. Механизм действия большинства из них неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Ca повышают устойчивость a-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты.

Оптимальный состав питательной  среды для каждого продуцента может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием компьютера. Последний, естественно, предпочтительнее. По характеру культивирования все  технологические процессы производства ферментных препаратов делятся на две большие группы: глубинный и поверхностный методы.

 

2. Глубинный метод производства ферментов

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной  среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании  продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

1. Приготовление питательных  сред зависит от состава компонентов.

Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.

2. Получение засевного материала.

Для засева питательной среды  материал готовят также глубинным  методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5-20%). Если же происходит обильное спороношение - сокращается до 1%.

3. Производственное культивирование.

Биосинтез ферментов в  глубинной культуре протекает в  течение 2-4 суток при непрерывной  подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-32оС. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в компьютер, который определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.

4. Выделение.

В мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15% ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы.

5. Получение товарной  формы.

3. Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой  увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые  частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку  для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования. Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной материал может  быть трёх видов:

- культура, выросшая на  твердой питательной среде;

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

В три этапа получают и  посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных  отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды. Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых  питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую  структуру среды. Для повышения  активности ферментов к отрубям  можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром  при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов. Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).