Технология производства ферментов

При иммобилизации ферментов  с использование систем двухфазного  типа ограничение свободы перемещения  фермента в объеме системы достигается  благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и  продукт ферментативного превращения  распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями  в этих фазах. Природа фаз подбирается  таким образом, что продукт накапливается  в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту  фазу отделяют и извлекают из нее  продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного процесса. Одним из важнейших  преимуществ систем двухфазного  типа является то, что они позволяют  осуществлять ферментативные превращения  макромолекулярных субстратов, которые  невозможны при применении жестких  носителей с ограниченным размером пор.

Главным отличительным признаком  химических методов иммобилизации  является то, что путем химического  взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые  ковалентные связи, в частности  между белком и носителем. Препараты  иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.

7. Оборудование для производства ферментов

Вибрационная установка  винтового типа непрерывного действия.

Вибрационная установка  винтового типа непрерывного действия производительностью 3,5 т/сутки.

Состоит из рамы, бункера  для отрубей, стерилизатора, вибростерилизатора и четырех последовательно соединенных герметизированных вертикальных вибрационных конвейеров лоткового типа. Собственно растильной частью установки являются первые три конвейера, составляющие соответственно первую, вторую и третью зоны роста. Четвертый конвейер предназначен для сушки культуры.

Каждый виброконвейер снабжен индивидуальным приводом с дебалансовыми вибраторами, трубопроводами для подачи среды соответственно на второй, третий и четвертый конвейеры.Стерильная засеянная питательная среда из вибростерилизатора поступает в приемный лоток первого виброконвейера и под влиянием виброимпульсов, сообщаемых желобу от вибропривода, перемещается снизу вверх. Из верхнего лотка первого виброконвейера среда по трубе поступает в нижний приемный лоток второго виброконвейера. Конструктивно второй виброконвейер отличается от первого только тем, что лотки его снабжены водяной рубашкой для отвода теплоты, выделяемой в период активного роста культуры. Для отвода продуктов жизнедеятельности микроорганизмов во второй виброконвейер подается кондиционированный воздух.

Из верхнего лотка второго  виброконвейера среда поступает по трубе в нижний приемный лоток третьего виброконвейера, устройство которого аналогично первому. Скорость движения среды по лоткам виброконвейеров составляет 2...3 мм/с, а диаметр и число витков всех виброконвейеров рассчитаны так, чтобы среда находилась в непрерывном движении в течение всего процесса роста.Из верхнего лотка третьего виброконвейера выращенная культура гриба по трубе поступает в нижний приемный лоток четвертого конвейера на сушку. Устройство этого виброконвейера идентично второму, но в рубашку лотков подают воду температурой 70 °С и дополнительно подводится воздух температурой 70...80 °С. Выращенная и высушенная культура гриба выгружается, а воздух после бактериальной очистки удаляется. Стерильный кондиционированный воздух, необходимый для аэрации в количестве 500... 1800 м3 на 1 т культуры, подается кондиционером.

Ферментаторы с механическим перемешиванием барботажного типа

Ферментаторы с механическим перемешиванием барботажного типа широко применяются для стерильных процессов выращивания микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ.

Ферментатор такого типа представляет собой вертикальный аппарат цилиндрической формы, изготовленный из стали Х18Н10Т или биметалла с эллиптическими крышкой и днищем. Отношение высоты к диаметру равно 2,6 : 1. На крышке аппарата расположен привод перемешивающего устройства, состоящий из электродвигателя, редуктора, муфты, подшипника и сальника. Здесь же установлены штуцеры для загрузки питательной среды и посевного материала, подачи и вывода воздуха, смотровые окна, люки для погружения моющей механической головки; предохранительный клапан.Для выгрузки культуры в днище аппарата предусмотрен спускной штуцер. Внутри корпуса проходит вал с закрепленными на нем перемешивающими устройствами, состоящими из закрытых турбин. Барботер соединен с трубой для подвода воздуха и выполнен в виде разборного ромба из перфорированных труб. В верхней его части расположены в шахматном порядке 2000...3000 отверстий. Вал и перемешивающие устройства с муфтами приводятся во вращение от мотор-редуктора.Ферментатор оборудован рубашкой, состоящей из 6...8 ярусов-секций. Каждая секция состоит из 8 навитых опоясывающих каналов, выполненных из уголкового профиля. площадь поверхности охлаждения рубашки 60 м2, внутренняя поверхность которой состоит из змеевиков диаметром 600 мм и общей высотой 2,4 м.Ферментатор рассчитан для работы под избыточным давлением 0,25 МПа и стерилизации при 130... 140 °С, а также для работы под разрежением. В процессе выращивания микроорганизмов давление внутри ферментатора в пределах 50 кПа; расход стерильного воздуха до 1 м3/мин. Высота столба жидкости в аппарате 5...6 м при высоте аппарата более 8 м. Для обеспечения стерильности процесса предусмотрены торцевые уплотнения вала перемешивающего устройства с паровой защитой. Торцевые уплотнения рассчитаны для работы при давлении до 0,28 МПа и остаточном давлении не ниже 2,7 кПа, температуре 30... 250 °С и частоте вращения вала до 500 мин-1. С помощью торцевых уплотнений удается практически полностью предотвратить утечку среды или попадание воздуха в полость аппарата в месте вывода вала. Торцевые уплотнения, соприкасающиеся с рабочей средой, изготовляются из стали Х18Н10Т и Х17Н13М2Т, а также из титана ВТ-10. Длительность безотказной работы торцевого уплотнения не менее 2000 ч при ресурсе работы 8000 ч. Допустимое радиальное биение вала в зоне торцевого уплотнения не более 0,25 мм, угловое биение вала не более 0,25°.

Наибольшее распространение  получили эрлифтные дрожже-растильные аппараты с внутренним циркуляционным контуром. Данные конструкции ферментаторов не имеют механических средств пеногашения. Пена гасится под тяжестью столба жидкости при ее циркуляции. Воздух в аппарат проходит по центральной трубе в кювету, где из подаваемого сусла и жидкости, содержащейся в нижней части аппарата, образуется газожидкостная смесь, которая движется по внутреннему диффузору. Часть воздуха отделяется от пены и выходит в атмосферу через отверстие в крышке аппарата, а другая часть вместе с пеной опускается по кольцевому зазору между диффузором и стенкой.При движении вниз пена гасится. Кратность циркуляции достигает 1,5...2 объема рабочей жидкости в минуту. Промышленные аппараты имеют высоту 12... 15 м. Пена поднимается до высоты 10... 12 м. Охлаждение ферментатора производится орошением наружной стенки и подачей воды в рубашку диффузора. Расход воздуха составляет 20 м3 на 1 кг сухих дрожжей.

Цилиндрический эрлифтный ферментатор

Цилиндрический эрлифтный ферментатор предназначен для непрерывного выращивания дрожжей на сусле, которое является отходом гидролизно-дрожжевого производства. Он представляет собой стальной сварной корпус с днищем в виде усеченного конуса и конической крышкой с центральным отверстием. Внутри аппарата установлены четыре диффузора, которые создают четыре самостоятельно циркулирующих потока. Через коллектор в центральные трубы каждого диффузора, на конце которых имеются конус и кювета, подается сжатый воздух.На крышке аппарата установлен распределительный бачок, куда через штуцера поступают бражка, сусло, засевные дрожжи и аммиачная вода. Все компоненты смешиваются и образуют, питательную смесь, которая свободным потоком по трубам диаметром 100 мм поступает вниз, в кюветы аэрирующего устройства.Питательная смесь, переливаясь через край кюветы, смешивается с воздухом, выходящим через щели под кюветой. Образовавшаяся воздушно-жидкостная эмульсия поднимается вверх по диффузору к отбойнику, откуда, разрушаясь, стекает вниз. Для наружного охлаждения стенок аппарата установлен ороситель в виде коллектора.

8. Применение иммобилизованных ферментов

Особенно ощутимый вклад  иммобилизованные ферменты внесли в  тонкий органический синтез, в анализ, в медицину, в процессы конверсии  энергии, в пищевую и фармацевтическую промышленности. Для синтетической органической химии важно то, что в двухфазных реакционных средах фермент сохраняет каталитическую активность даже при исключительно малом содержании воды, поэтому равновесие катализируемой реакции (выход продукта) экспериментатор может регулировать в широких пределах, подбирая нужный органический растворитель. Иммобилизованные ферменты дали толчок к созданию принципиально новых методов "безреагентного" непрерывного анализа многокомпонентных систем органических (в ряде случаев и неорганических) соединений. В будущем важную роль в контроле окружающей среды и в клинической диагностике должны сыграть такие методы, как биолюминесцентный анализ и иммуноферментный анализ. В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме. Проблемы биоконверсии массы и энергии в настоящее время пытаются решить микробиологическим путем. Тем не менее иммобилизованные ферменты вносят ощутимый вклад в осуществление фотолиза воды и в биоэлектрокатализ. Заслуживает внимание и использование иммобилизованных ферментов в процессах переработки лигноцеллюлозного сырья.

Иммобилизованные ферменты могут использоваться и как усилители  слабых сигналов. На активный центр  иммобилизованного фермента можно  подействовать через носитель, подвергая  последний ультразвуковой обработке, механическим нагрузкам или фотохимическим превращениям. Это позволяет регулировать каталитическую активность системы  фермент - носитель под действием  механических, ультразвуковых и световых сигналов. На этой основе были созданы  механо- и звукочувствительные датчики и открыт путь к бессеребряной фотографии. Промышленные процессы с применением иммобилизованных ферментов внедрены прежде всего в пищевую и фармацевтическую промышленность. В пищевой промышленности с участием иммобилизованных ферментов идут процессы получения глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др. В медицине иммобилизованные ферменты используются также как лекарственные препараты, особенно в тех случаях, когда необходимо локальное воздействие. Кроме того, биокатализаторы широко используются в различных аппаратах для перфузионной очистки различных биологических жидкостей. Возможности и перспективы использования в медицине ферментов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые на сегодняшний день, именно на этом пути медицину ждет создание новых высокоэффективных методов лечения.

9. Рынок ферментов и ферментных препаратов

Объем отечественного рынка  ферментов, по данным Минпромнауки, составляет около 40 млн долларов, при этом на долю российских производителей приходится 30%. Однако подобное соотношение импортной и отечественной продукции характерно не для всех областей использования ферментов. Основными потребителями отечественных ферментов и ферментных препаратов являются спиртовая промышленность и кормопроизводство.Ферменты представляют собой органические вещества, производимые живыми клетками, они способны инициировать и регулировать специфические химические реакции снаружи или внутри живых клеток, при этом в самих ферментах не происходит какого-либо изменения их химической структуры.

Взаимообусловленные факторы, разнонаправленные тенденции

Развитие рынка ферментов  зависит от двух взаимосвязанных  факторов -- возможности и экономической целесообразности их применения и возможности их промышленного производства. Слабое использование этих препаратов в недавнем прошлом в различных отраслях пищевой промышленности (как, впрочем, и в других отраслях) объяснялось, с одной стороны, отсутствием способов промышленного производства самих ферментов по экономически целесообразным ценам, а с другой -- отсутствием способов их применения в отраслях-потребителях. Однако совершенствование производства ферментных препаратов и технологий их применения в различных отраслях промышленности способствовало активизации их использования.

При этом появление интереса в отраслях-потребителях к какому-либо новому ферменту побуждает производителей разрабатывать и предлагать рынку  его пробные образцы. Если новый  фермент не находит спроса по предлагаемым ценам, проект на время откладывается. Это означает, что, скорее всего, будет  совершенствоваться технология производства данного фермента, чтобы она стала  коммерчески выгодной. Однако возможна ситуация, когда меняется конъюнктура  рынка, т. е. вырастают цены на химические препараты, которые применяются  в технологиях отраслей-потребителей. В таком случае могут быть востребованы данные ферменты по первоначальной цене или по цене, близкой в первоначальной. Следует отметить, что со временем совершенствование технологий производства ферментов приводит к снижению цен на них. Так, мировые цены на альфа-амилазу и глюкоамилазу за последние 10 лет снизились в два раза, при той же или даже большей эффективности самих ферментов.

Существует несколько  направлений снижения себестоимости  производства ферментов. Одно из них -- техническое усовершенствование процесса получения хорошо известного продукта, разработка более экономичных процессов, зачастую на основе новых модификаций бактерий. Работа в этом направлении позволяет снижать затраты на производство ферментов и, соответственно, цены. Наглядным примером может служить развитие промышленного производства липаз. Они стали востребованы масложировой промышленностью, когда цены на них на мировом рынке снизились до приемлемого для потребителей уровня.

Другое направление -- поиск новых ферментов с интересными свойствами, способных более эффективно выполнять аналогичные задачи. Для этого специалисты ведут поиск новых бактерий в различных регионах мира, из которых впоследствии выбирают самые эффективные продуценты, подходящие для коммерческого использования.

Аналитики отмечают, что  динамика стоимости производства химических препаратов, которые производятся из не возобновляемого сырья, и динамика стоимости производства ферментных препаратов за последние годы имеют  противоположные тенденции, первая -- увеличивается, вторая -- снижается. Это позволяет все шире использовать биотехнологические процессы во многих отраслях. Немаловажную роль в развитии рынка ферментов играет и тот факт, что во многих развитых странах существенно возрос интерес к экологически чистым продуктам. Это подтверждается тем, что темпы роста производства таких продуктов питания (около 25% в год) значительно опережают общий рост производства продуктов питания. Так, объемы их производства вышли на уровень 25 млрд долларов. По оценке зарубежных специалистов, к 2020 году этот объем увеличится на порядок. В настоящее время в странах Евросоюза, в США и Японии уже существуют национальные системы стандартов по экологически чистым продуктам питания. В этих программах доминирующую роль играют ферменты и ферментные препараты, которые являются натуральными биологическими препаратами и позволяют исключить применение различных химических и гормональных препаратов. Помимо этого, использование ферментов в производстве продуктов питания практически всегда снижает нагрузку на экологическую обстановку вокруг предприятия. Эти природные организмы либо являются биоразлагаемыми, либо их присутствие не оказывает негативного воздействия на окружающую среду.