Технология производства ферментов

Выросшая в неподвижном  слое при поверхностном культивировании  культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся  мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности  при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют  прямо в неочищенном виде - в  кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской  промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к  следующему:

- освобождение от нерастворимых  веществ;

- освобождение от сопутствующих  растворимых веществ;

- фракционирование (как правило,  хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности. Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др. Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

4. Иммобилизация ферментов

Общая характеристика иммобилизованных ферментов

В современной биотехнологии  одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы  при хранении, а также чувствительны  к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении  их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому  методу было положено в 1916 году, когда  Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

Сущность иммобилизации  ферментов -- прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1--0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер. Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:

1. Гетерогенный катализатор  легко отделим от реакционной  среды, что дает возможность  остановить реакцию в любой  момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от  фермента продукт.

2. Ферментативный процесс  с использованием иммобилизованных  ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой  реакции и выход продукта.

3. Модификация фермента  целенаправленно изменяет его  свойства, такие как специфичность  (особенно в отношении макромолекулярного  субстрата), зависимость каталитической  активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

4. Можно регулировать  каталитическую активность иммобилизованных  ферментов путем изменения свойств  носителя действием физических  факторов, таких как свет и  звук. Иммобилизовать ферменты можно  как путем связывания на нерастворимых  носителях, так и путем внутримолекулярной  или межмолекулярной сшивки белковых  молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру

5. Классификация носителей для ферментов

Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и  неорганических носителей. К носителям  предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974):

высокая химическая и биологическая  стойкость;

высокая химическая прочность;

достаточная проницаемость  для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

возможность получения в  виде удобных в технологическом  отношении форм (гранул, мембран);

легкая активация;

высокая гидрофильность;

невысокая стоимость.

Классификация носителей  схематично представлена на рисунке

Классификация носителей  для иммобилизованных ферментов

Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные. Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные.

Для иммобилизации ферментов  наиболее широко используются природные  полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров - неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость. Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и т.д.

Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под  названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине.

Хорошим носителем считается  агар. Его свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется.

Белки в качестве носителей  обладают рядом достоинств: вместительны, способны к биодеградации, могут  применяться в качестве тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов  на белковых носителях можно проводить  как в отсутствие, так и в  присутствии сшивающих агентов. Белки используются и в фундаментальных  биологических исследованиях, и  в медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят  их высокую иммуногенность (за исключением  коллагена и фибрина). Наиболее для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.

Синтетические полимерные носители применяются для ковалентной  и сорбционной иммобилизации  ферментов, для получения гелей, микрокапсул. Полимеры на основе стирола  применяются сорбционной иммобилизации. Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру. Для получения полимерных гидрофильных носителей широко используется акриламид - производное акриловой кислоты.

Широкое распространение  получил метод включения ферментов  и клеток в полиакриламидный гель, имеющий жесткую пространственную сетчатую структуру. Полиакриламидный гель устойчив к химическим воздействиям. Очень интересную группу представляют полиамидные носители. Это группы различных гетероцепных полимеров  с повторяющейся амидной группой  -С(О)-NH-. Например, полимеры на основе N-винилпирролидона используются для получения иммобилизованных ферментов, способных медленно распадаться в организме. Кроме того, они биологически инертны, что особенно важно при использовании в медицинских целях. Существенным недостатком большинства полимерных носителей является их способность накапливаться в организме. В этом отношении предпочтение отдается природным полимерам, которые гидролизуются ферментами. Поэтому в состав лекарственных препаратов часто входит декстран, а из синтетических носителей - полимеры на основе N-винилпирролидона. В настоящее время ведутся эксперименты по созданию синтетических полимеров, расщепляющихся с образованием нетоксичных продуктов обмена.

6. Методы иммобилизации ферментов

Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический.

Физическая иммобилизация  ферментов представляет собой включение  фермента в такую среду, в которой  для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент  не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

- адсорбция на нерастворимых  носителях;

- включение в поры геля;

- пространственное отделение  фермента от остального объема  реакционной системы с помощью  полупроницаемой перегородки (мембраны);

- включение в двухфазную  среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б - включение в поры геля, в - отделение  фермента с помощью полупроницаемой  мембраны, г - использование двухфазной реакционной среды

Адсорбционная иммобилизация  является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов, начало ей было положено еще в 1916 г. Этот способ достаточно прост и достигается  при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента.

Некоторых из перечисленных  затруднений можно избежать при  иммобилизации ферментов путем  включения в гели. Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в  трехмерную сетку из тесно переплетенных  полимерных цепей, образующих гель. Среднее  расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного  фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в  окружающий раствор, т.е. находится  в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды.

Для иммобилизации ферментов  в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем  проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с  включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто  добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Общий принцип иммобилизации  ферментов с использованием мембран  заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного  раствора субстрата полупроницаемой  перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных  молекул фермента. Существующие модификации  этого метода различаются лишь способами  получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые  сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек относятся также включение в волокна (при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити) и включение в липосомы. Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием фермента. Метод, как и предыдущий, достаточно универсален, т.е. применим как ферментам, так и к клеткам, а также их фрагментам. Благодаря высокому отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. Основной недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.