Разработка методики выполнения измерений определения мочевой кислоты в крови

Для удаления белков чаще всего  использовали вольфрамовую, трихлоруксусную  или фосфорно-вольфрамовую кислоты. Для окисления мочевой кислоты  применяли арсено-вольфрамовую кислоту, арсено-фосфорно-вольфрамовую кислоту, арсеномолибденовую кислоту, феррицианид калия и уранилацетат. Для повышения специфичности данной группы методов использовали адсорбцию мочевой кислоты на ионообменных смолах. Вмешательство соединений, содержащих SH-группы, нейтрализовали N-этилмалеимидом [9].

В 1953 г. S. Natelson [10] предложил модифицированный метод O. Folinа в качестве «стандартного» метода определения мочевой кислоты. Окисляющий агент представлял собой фосфорно-вольфрамовую кислоту в присутствии цианида натрия и мочевины. Этот метод также не обладал высокой специфичностью; в реакцию способны вмешиваться соли железа, глютатион, фенолы, аскорбиновая кислота, глюкоза, тирозин, триптофан, цистин и цистеин.

Позднее, в 1964 г., была предложена еще  одна модификация метода O. Folin и W. Denis, в котором растворы карбоната натрия и фосфорно-вольфрамовой кислоты добавляли к фильтрату после осаждения белков реактивом Folin-Woo. Этот метод хотя и облегчал процедуру определения, но приводил к результатам, которые на 7% были выше, чем в методе с цианидом и мочевиной [11].

В данной группе методов удаление белков является обязательным условием. Другим условием было поддержание рН в среде инкубации выше 6,0, что  позволяет удержать малорастворимую  мочевую кислоту в растворе.

По общему мнению, методы, основанные на восстановлении фосфорно-вольфрамового реактива мочевой кислотой, чувствительны ко многим соединениям, включая глюкозу, аскорбиновую кислоту, глютатион, цистеин, попадающим в плазму из гемолизированных эритроцитов. Мешают определению многие лекарственные препараты: ацетоаминофенон, ацетилсалициловая кислота и ее метаболиты, кофеин, теобромин, теофиллин. Все они способны восстанавливать реактив, приводя к ложному завышению результатов. Многочисленные модификации метода не способствовали существенному повышению его специфичности.

Ферментативные (уриказные) методы являются более специфичными, поскольку окисление  мочевой кислоты протекает под действием фермента уриказы, обладающего высокой субстратной специфичностью. Эти методы стали особенно популярными после появления на рынке высококачественных и недорогих препаратов фермента бактериального происхождения. В данных методах не требуется предварительного осаждения белка. Несмотря на то, что в ход уриказной реакции могут вступать некоторые структурные аналоги мочевой кислоты, гуанин и ксантин, при их концентрации в биологической жидкости они не оказывают влияния на результаты [12].

Уриказные методы основаны на реакции  окисления мочевой кислоты до аллантоина и образовании перекиси водорода (рисунок 2).

 

Рисунок 2 – Реакция окисления мочевой кислоты

Аллантоин, в отличие от МК, не имеет пика поглощения при 290-293 нм. Определение величины поглощения при этих длинах волн до и после инкубации мочевой кислоты с уриказой использовали для определения МК в сыворотке, плазме и моче [13]. Уриказные методы в настоящее время полностью вытеснили неспецифичные «редукционные» методы.

Реакция может проводиться как  в режиме непрерывной регистрации, так и с фиксированным временем инкубации. Уменьшение величины поглощения, обусловленное окислением мочевой кислоты в среде инкубации, контролируется спектрофотометрически при длине волны от 282 до 292 нм.

В методах с использованием сопряженных  реакций определяют количество перекиси водорода, образующейся в уриказной  реакции. В индикаторных реакциях используют либо пероксидазу, либо каталазу [14]. Последовательность реакций (основной и вспомогательной) при определении мочевой кислоты с участием ферментов уриказы и каталазы приведена на рисунке 3:

 

Рисунок 3 – Последовательность реакции  при определении мочевой кислоты

Во вспомогательной реакции, катализируемой каталазой, образуется формальдегид, который  вступает в реакцию с ацетилацетоном и аммиаком. При этом образуется комплекс, окрашенный в желтый цвет, – 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин (рисунок 4).

 

Рисунок 4 – Реакция получения 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин

Количество данного продукта реакции  определяют по поглощению при 410 нм [15].

В современных ферментативных методах  определения мочевой кислоты в сыворотке используют пероксидазную систему c образованием окрашенного продукта реакции [16]. Перекись водорода, образующуюся при окислении мочевой кислоты под действием уриказы, определяют количественно окислением o-дианизидина и определением поглощения при 530 нм [17]. 3-Метил-2-бензотиазолинон и N,N,-диметиланилин в присутствии пероксидазы и перекиси водорода образуют окрашенный комплекс, величину поглощения определяют при 600 нм [18]. Перекись водорода может реагировать с 3,5-дихлор-2-гидроксибензолсульфоновой кислотой и 4-аминофеназоном с образованием окрашенного в красный цвет комплекса [19]. 4-Аминофеназон или его производные, в настоящее время наиболее часто используемые акцепторы кислорода в сопряженных реакциях, были предложены P. Trinder [20]. Подобная схема используется при определении глюкозы и холестерина, триглицеридов и многих других соединений [21].

Перекись водорода, образующуюся в уриказной реакции, выявляют реакцией окисления этанола до ацетальдегида, запускаемой каталазой, и окисления  ацетальдегида до ацетата в присутствии  альдегиддегидрогеназы и НАД. Измеряют поглощение при длине волны 340 нм (рисунок 5) [22].

 

Рисунок 5 – Реакции получения  ацетальдегида и ацетата

Для определения мочевой кислоты предлагали использовать методы ВЭЖХ с обращенной фазой. Был разработан высокочувствительныйи метод ион-парной хроматографии для одновременного определения в биологических жидкостях мочевой кислоты, гипоксантина, ксантина при 280 нм [23]. Для определения мочевой кислоты с применением ВЭЖХ предлагали использовать плазму вместе с внутренним стандартом, поглощение определяли спектрофотометрически при 254 нм [24]. Эти методы являются специфичными и быстрыми; подвижные фазы просты по составу, время удержания мочевой кислоты – менее 6 мин – условия, приемлемые для использования метода в качестве референтного. Первичным методом определения мочевой кислоты является масс-спектрометрия с изотопным разведением [25]. Коэффициент вариации определения составляет от 0,34 до 0,42%. Аппаратура, требуемая для этого метода, недоступна в большинстве лабораторий.

Скорость потребления  кислорода в реакции окисления  мочевой кислоты в сыворотке и моче при участии уриказы определяли с помощью полярографического электрода [26].

Для определения мочевой  кислоты в сыворотке и моче применяют кулонометрический метод  с использованием уриказы [27]. Он основан на определении общего количества редуцирующих соединений, образующихся при кулонометрическом титровании йодом до и после реакции с уриказой. Разность этих значений отражает уровень мочевой кислоты в образце.

Для определения мочевой кислоты в 1979 г. в качестве референтного метода была предложена высокоэффективная жидкостная хроматография. Преимущества данного метода, несмотря на его сложность и дороговизну, заключаются в высокой чувствительности и специфичности. Только метаболиты теофиллина (метилмочевая кислота) способны исказить результаты определения мочевой кислоты в моче данным методом. Коэффициент вариации составляет от 1 до 2%. Линейность сохраняется до 200 мг/л.

Реакция 3,5-дихлор-2-гидроксибезолсульфоната  с 4-аминофеназоном в присутствии пероксидазы в сочетании с ферментативным окислением мочевой кислоты обладает достаточной чувствительностью для рутинных исследований. Вмешательство билирубина устраняется добавлением в реактив феррицианида. Добавление аскорбатоксидазы устраняет вмешательство аскорбиновой кислоты в реакцию азосочетания.

Американская ассоциация клинической  химии (AACC) предложила уриказный метод  в качестве кандидата на референтный  метод определения мочевой кислоты [28]. Для того чтобы уменьшить высокое поглощение реакционной среды в ультрафиолетовой области в методе с фиксированным временем инкубации, рекомендуют осаждение белка трихлоруксусной кислотой. Скорость уменьшения поглощения при 283 нм используют для регистрации окисления мочевой кислоты до аллантоина, катализируемой уриказой. Коэффициент вариации метода составляет от 2,6% при 30 мг/л до 1,5% при 99 мг/л. Метод сохраняет линейность до 200 мг/л. Из 20 соединений (включая лекарственные препараты и их метаболиты, возможные конкурентные ингибиторы, тиолы, антикоагулянты, консерванты) только ксантины способны вмешиваться в неавтоматизированный уриказный метод. Полагают, что ряд других соединений, включая ЭДТУК и фторид натрия, могут влиять на ход реакции, искажая результат.

Для рутинных исследований предпочтение отдают автоматизированному ферментативному методу с использованием готовых тест-систем. Этот метод является и точным, и воспроизводимым и легко адаптируется ко многим анализаторам [28].

1.3 Характеристика выбранного метода определения

Фотометрия, раздел прикладной физики, занимающийся измерениями света. С точки зрения фотометрии, свет – это излучение, способное вызывать ощущение яркости при воздействии на человеческий глаз. Такое ощущение вызывает излучение с длинами волн от ~0,38 до ~0,78 мкм, причем самым ярким представляется излучение с длиной волны около 0,555 мкм (желто-зеленого цвета). Поскольку чувствительность глаза к разным длинам волн у людей неодинакова, в фотометрии принят ряд условностей. В 1931 Международная комиссия по освещению (МКО) ввела понятие «стандартного наблюдателя» как некоего среднего для людей с нормальным восприятием. Этот эталон МКО – не что иное, как таблица значений относительной световой эффективности излучения с длинами волн в диапазоне от 0,380 до 0,780 мкм через каждые 0,001 мкм. Яркость, измеренная в соответствии с эталоном МКО, называется фотометрической яркостью или просто яркостью.

Основные виды фотометрических  измерений таковы:

1) сравнение силы света  источников;

2) измерение полного  потока от источника света;

3) измерение освещенности  в заданной плоскости; 

4) измерение яркости  в заданном направлении; 

5) измерение доли света,  пропускаемой частично прозрачными  объектами; 

6) измерение доли света,  отражаемой объектами. 

Существуют два общих метода фотометрии:

1) визуальная фотометрия, в которой при выравнивании  механическими или оптическими  средствами яркости двух полей  сравнения используется способность  человеческого глаза ощущать  различия в яркости; 

2) физическая фотометрия, в которой для сравнения двух  источников света используются различные приемники света иного рода – вакуумные фотоэлементы, полупроводниковые фотодиоды и т.д.

Метод анализа, основанный на переведении определяемого компонента в поглощающее свет соединение с  последующим определением количества этого компонента путём измерения светопоглощения раствора полученного соединения, называется фотометрическим.

По окраске растворов  окрашенных веществ можно определять концентрацию того или иного компонента или визуально, или при помощи фотоэлементов – приборов, превращающих световую энергию в электрическую. В соответствии с этим различают фотометрический визуальный метод анализа, называемый часто колориметрическим, и метод анализа с применением фотоэлементов – собственно фотометрический метод анализа. Фотометрический метод является объективным методом, поскольку результаты его не зависят от способностей наблюдателя, в отличие от результатов колориметрического – субъективного метода.

Фотометрический метод  анализа – один из самых старых и распространённых методов физико-химического анализа. Его распространению способствовали сравнительная простота необходимого оборудования, особенно для визуальных методов, высокая чувствительность и возможность применения для определения почти всех элементов периодической системы и большого количества органических веществ. Открытие всё новых и новых реагентов, образующих окрашенные соединения с неорганическими ионами и органическими веществами, делает в настоящее время применение этого метода почти неограниченным.

Фотометрический метод анализа может применяться для большого диапазона определяемых концентраций. Его используют как для определения основных компонентов различных сложных технических объектов с содержанием до 20-30% определяемого компонента, так и для определения микропримесей в этих объектах при содержании их до 10^-3-10^-4 %. Комбинирование фотометрических методов с некоторыми методами разделения – хромотографическим, экстракционным позволяет на 1-2 порядка повысить чувствительность определения, доведя его до 10-5 [29].

Основной закон фотометрии – закон Бугера–Ламберта–Бера  записывается следующим образом:

 

  ,                                                                  (1)