Разработка методики выполнения измерений определения мочевой кислоты в крови

9.3 Приготовление аттестованных смесей для установки градуировочной характеристики.

9.3.1 Серная кислота, 0,35 моль/л: к 200 мл воды добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты относительной плотности 1,84 и доводят объем водой до 500 мл.

9.3.2 Натрий вольфрамовокислый двухводный (Na₂WO₄∙2H₂O), 100 г/л: растворяют 50 г вольфрамовокислого натрия в небольшом количестве воды и доводят объем до 500 мл.

9.3.3 Натрия карбонат, 103 г/л: растворяют 51,5 г натрия карбоната в небольшом количестве воды и доводят объем до 500 мл.

9.3.4 Фосфорновольфрамовый реактив; в круглодонную колбу вместимостью 1,5 л вносят 40 г вольфрамовокислого натрия и 300 мл воды. Добавляют 32 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты и несколько стеклянных бусинок. Осторожно кипятят в течение 2 ч на песочной или глицериновой бане с обратным холодильником. Охлаждают до комнатной температуры и доливают водой до 1 л. Добавляют 32 г сульфата лития. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.

9.3.5 Основной калибровочный раствор мочевой кислоты, 6 ммоль/л: растворяют 0,6 г карбоната лития в 150 мл воды, фильтруют и нагревают до 60 °С. Взвешивают 1,017 г мочевой кислоты, вносят в предварительно нагретую колбу вместимостью 1 л, вливают теплый раствор карбоната лития и быстро встряхивают. После растворения мочевой кислоты колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 20 мл раствора формалина, наливают 300-350 мл воды. Добавляют несколько капель раствора метилового оранжевого, затем встряхивают, медленно добавляют 20-22 мл 0,35 моль/л серной кислоты до изменения цвета в розовый. Доливают колбу до метки водой. Раствор стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла; 1 мл раствора содержит 0,006 ммоль мочевой кислоты.

9.3.6 Рабочий калибровочный раствор мочевой кислоты, 0,03 ммоль/л: 1 мл основного калибровочного раствора доводят до 200 мл водой. Стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.

9.4 Отбор проб

Отбор проб крови, в зависимости  от поставленной задачи, производят из пальца, вены, пупочной вены в химически  чистые, обеззараженные пробирки с  пришлифованными пробками объемом 1-5 см³.

Забор крови производится строго натощак (спустя 6-8 часов после последнего приема пищи). В течение нескольких дней до исследования необходимо придерживаться низкопуриновой диеты, избегать употребления алкоголя или необходимо предупредить врача об их употреблении.

9.5 Подготовка проб к анализу

Опытная проба: к 8 мл воды добавляют 1 мл сыворотки крови, 0,5 мл 0,35 моль/л  серной кислоты и перемешивают. Затем  добавляют 0,5 мл раствора вольфрамовокислого натрия и тщательно перемешивают. Через 5-10 мин фильтруют. К 3 мл фильтрата  добавляют 1,5 мл раствора натрия карбоната, перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфорновольфрамового реактива, перемешивают, переворачивая пробирку. Через 30 мин измеряют в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 590-700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл воды.

Калибровочную пробу ставят и измеряют так же, как опытную, но вместо фильтрата  берут 3 мл рабочего калибровочного раствора.

10 Операции при выполнении  измерений

Полученные после подготовки к анализу растворы проб крови и растворы холостой, калибровочной проб измеряют на фотоэлектроколориметре, подготовленном для определения мочевой кислоты.

Берут 3 кюветы одинаковой рабочей  длины; 2 из них заполняют калибровочной и холостой пробой, а одну – опытным образцом.

Измерение на ФЭКе производят в следующем порядке:

1 В левый кюветодержатель ставят кювету с холостой пробой, а в правый –кювету с опытным образцом.

2 В правый пучок света помещают кювету с опытным образцом.

3 Открывают шторку, при этом стрелка микроамперметра отклоняется от нуля; вращая левый отсчетный барабан от себя, подводят стрелку микроамперметра к нулю.

4 Закрывают шторку.

5 Рукояткой кюветодержателя перемещают кюветы в правом кюветодержателе, так чтобы в правом пучке света оказалась кювета с холостой пробой.

6 Открывают шторку, стрелка микроамперметра снова отклоняется от нулевого положения.

7 Вращая правый отсчетный барабан от себя, возвращают стрелку микроамперметра к нулю.

8 Закрывают шторку.

9 Снимают показания прибора по красной шкале правого отсчетного барабана.

10 Для исключения случайных ошибок повторяют измерение еще два раза. Для расчетов можно брать повторяющиеся результаты с незначительным расхождением.

Закончив измерение данного раствора, необходимо его тотчас вылить из кюветы, которую необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и поставить в перевернутом виде на чистую фильтровальную бумагу.

Те же операции проводят и с калибровочной  пробой.

Если на ФЭКе в течение дня  работа больше не будет производиться, то выливают растворитель из кюветы и споласкивают их дистиллированной водой. Все кюветы вытирают досуха и убирают. ФЭК отключают и закрывают чехлом. Рекомендуется при работе закрывать кюветы крышками, чтобы предотвратить проливание жидкости внутри прибора. Если работают с летучими жидкостями, закрывать кюветы надо обязательно.

11 Операции обработки  и вычислений результатов измерений

Концентрация мочевой кислоты, ммоль/л, определяется по следующей  формуле:

 

,                                                                (1)

 

где Е_оп – экстинкция опытной пробы;

 Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

 С_к – концентрация рабочего калибровочного раствора, 0,03 ммоль/л;

10 – пересчет на объем сыворотки  (в опытную пробу берут 0,3 мл, т.е. в 10 раз меньше, чем в калибровочную пробу).

Результаты вычислений округляют  до двух знаков после запятой.

Контроль приемлемости результатов  параллельных определений, полученных при анализе рабочей пробы, осуществляют путем вычисления абсолютного значения разности между параллельными определениями и сравнения его с пределом повторяемости – r = 2,8∙σ_r.

12 Алгоритм оценивания  неопределенности измерения

Методика оценивания неопределенности результатов измерения приведена в Приложении А.

13 Контроль лабораторного смещения

Порядок оценки лабораторного смещения осуществляется в соответствии с п.5 СТБ ИСО 5725-4-2002.

В качестве эталонного материала при  оценке лабораторного смещения используются образцы крови с известным содержанием мочевой кислоты, установленным другим стандартным методом, имеющим характеристики точности не меньше, чем у методики, описанной в настоящем документе.

14 Контроль стабильности  результатов измерений в лаборатории

Описание процедур контроля стабильности повседневных результатов измерений в лаборатории и стабильности результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, а также используемые для этих целей методы описаны в пп.5.3-6.2 СТБ ИСО 5725-6-2002.

15 Требования к оформлению  результатов измерений

Результат количественного химического анализа по данной методике представляют по следующей формуле:

 

Х± 2∙u_c ,                                                              (2)

где    Х – результат анализа, ммоль/л;

2 – коэффициент охвата для  выбранного уровня доверия р=0,95;

u_c – суммарная неопределенность, ммоль/л.

Значения содержания мочевой кислоты в пробе и суммарная неопределенность должны содержать одинаковое количество знаков после запятой.

Результаты измерений оформляются  по форме, установленной действующей в лаборатории системой регистрации данных, и должны включать следующую информацию:

– наименование (шифр) пробы;

– дату проведения измерений;

– результаты измерений, включая все  необходимые данные и промежуточные расчеты;

– результаты параллельных измерений;

– средний результат измерений;

– расхождение между параллельными  определениями;

– вывод о приемлемости;

– результат количественного химического  анализа;

– фамилию оператора.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПРИЛОЖЕНИЕ А

 

Методика оценивания неопределенности результатов измерения

 

Оценка неопределенности результатов измерения осуществляется следующим образом:

1 Описание процесса измерения  и составление его модели

Измеряемую величину следует  представить через функциональную зависимость:

,                                                              (1)

где   С_x, Е_оп, Е_к – называются входными величинами,

X-выходная величина.

2 Оценивание значений  и стандартных неопределенностей  входных величин

2.1 Концентрация рабочего калибровочного раствора – С_к

Влияющими факторами на концентрацию рабочего калибровочного раствора являются следующие параметры:

– степень частоты Р

Степень частоты мочевой кислоты указана в сертификате производителя в виде «значение ± а». Для получения стандартной неопределенности u(P) воспользуемся прямоугольным распределение:

 

,                                                                (2)

 

– масса m

Неопределенность, связанную с массой мочевой кислоты оценивают, используя данные сертификата о калибровке весов и документацию производителя.

Производитель весов дает значение ± b мг. предполагается, что указанные пределы можно рассчитывать как границы прямоугольного распределения и пересчитать в стандартную неопределенность следующим образом:

 

,                                                               (3)

 

– объем раствора

Объем подвержен трем источникам неопределенности:

1. Неопределенность указанного внутреннего объема колбы

Производитель мерной посуды указывает  объем колбы 1000мл ± с, относящийся к 20°С. В данном случае стандартная неопределенность вычисляется исходя из предложения о треугольном распределении

 

u₁= ,                                                                      (4)

2. Отклонение при заполнении колбы до метки

Неопределенность, вызванную отклонением при заполнении колбы, можно определить экспериментально, определяя сходимость результатов. Проводим серию из 10 опытов по заполнению водой и взвешиванию колбы вместимостью 1000мл. по полученным результатам вычисляем стандартное отклонение:

 

,                                                                         (5)

 

Его можно прямо использовать как  значение стандартной неопределенности.

3. Отличие температуры колбы от температуры, при которой проводилась калибровка

Стандартная неопределенность рассчитывается исходя из предложении о прямоугольном  распределении:

 

,                                                                            (6)

 

Эти три вклада суммируют, получая стандартную неопределенность u(V) объема V:

 

,                                                               (7)

 

Все перечисленные составляющие и  определяют стандартную неопределенность u(C_к) концентрации:

 

,                                               (8)

 

2.2 Экстинкция опытной пробы Е_оп

Неопределенность связанную с экстинкцией оценивают, используя данные о калибровке ФЭК и документацию производителя.

 

,                                                                  (9)

 

2.3 Экстинкция калибровочной пробы Е_к аналогично экстинкции опытной пробы.

2.4 Оценка пригодности метода дает сходимость результатов ( в виде относительного стандартного отклонения). Это значение можно использовать непосредственно для вычисления суммарной стандартной неопределенности, связанной с различными составляющими сходимости.

3 Расчет оценки выходной величины

Оценка выходной величины – это  результат измерений. Оценку рассчитывают, подставляя в формулу оценки входных величин, то есть

 

,                                                              (11)

 

4 Расчет стандартной неопределенности выходной величины

Стандартная неопределенность выходной величины рассчитывается суммированием  стандартных неопределенностей  входных величин с учетом коэффициентов  чувствительности