Применение метода спектрофотометрии в видимой области в анализе лекарственных средств

     Обычно для получения спектров требуется от 0,1 до 100 мг вещества в зависимости от молярного коэффициента поглощения. Растворы, применяемые в спектрофотометрии, являются очень разведенными, что обусловливает необходимость точного взвешивания образца и точного отмеривания раствора при последующих разведениях. Подходящей для измерений концентрацией является та, которая обеспечивает показания поглощения между 0,2 и 0,7, что соответствует пропускаемости от 65 до 20%.

     Определенное повышение точности спектрофотометрического анализа достигается путем, так называемой дифференциальной фотометрии. Этот метод основан на сравнении поглощения неизвестного раствора и поглощения стандартного раствора, последний подобран таким образом, что разница в поглощениях будет находиться в пределах, в которых измерение может быть выполнено с достаточной точностью. Дифференциальный способ принят Скандинавской фармакопеей в качестве основного метода для спектрофотометрических определений.

     Согласно одному из вариантов дифференциального метода измерение проводится путем сравнения неизвестного вещества при определенной величине рН к той же концентрации вещества, но при другой, отличной от первой, величине рН.

     Таким образом определяется содержание гексахлорофена в жидком мыле по Фармакопее США XVII. Так как ряд веществ не показывает изменений в спектральных характеристиках при изменении рН, дифференциальный метод для фенолов можно считать более специфичным, чем химический метод.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.4 Кривые поглощения

     Электронные спектры молекул графически изображаются |В виде кривых поглощения. Для этого наносят по оси ординат единицы поглощения, а по оси абсцисс - единицы длин волн. Единицы поглощения обычно выражают в виде абсолютного поглощения А, удельного показателя поглощения Е (1%, 1 см) или молярного показателя поглощения, или в процентах пропускания Т. Значения волн выражают в нанометрах (нм), иногда в волновых числах и редко в ангстремах (Å).

     Так как величина поглощения зависит от концентрации раствора и толщины слоя, то при построении кривых поглощения рекомендуют переводить ее в молярный показатель поглощения, который является характерным для вещества.

    Однако при условии постоянной толщины слоя и одинаковой концентрации построение графика зависимости поглощение - длина волны является наиболее удобным для быстрого установления характера спектра и количественных определений. Последний способ изображения принят большинством фармакопей.

     Электронные спектры поглощения неорганических и органических веществ издаются в разных странах периодически в виде отдельных сборников. Число таких спектров достигает обычно нескольких сотен, что затрудняет работу аналитиков, интересующихся спектрами лекарственных веществ и близких к ним соединений. Данное обстоятельство говорит о целесообразности выпуска атласов ультрафиолетовых спектров лекарственных веществ.

 

 

3.5 Калибровка спектрофотометров

     Приборы следует проверять время от времени в отношении шкалы длин волн и точности фотометрической шкалы поглощения (разрешающая способность прибора).

     Наилучшим источником для калибровки шкалы длин волн является ртутно-кварцевая лампа, линии которой при 239,95, 248,30, 253,65, 280,4, 302,25, 313,16, 334,15, 365,48, 404,66, 435,83, 546,1, 578,0, 623,44, 671,52 и 690,72 нм рекомендуются большинством фармакопей. Линии спектра газоразрядной водородной лампы при 486,13 и 656,28 нм могут быть также использованы. Шкалу длин волн проверяют при помощи подходящих стеклянных фильтров, которые имеют характерные полосы поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях. Рекомендованы стандартные стекла, содержащие дидимий (смесь редкоземельных элементов празеодимия и неодимия). Известно также применение для этих целей стекла, содержащего холмий.

     Шкалу поглощения проверяют, по цветным фильтрам, имеющим стандартное поглощение, или по стандартным растворам щелочного хромата калия или подкисленного бихромата калия. Рекомендуются также растворы сульфата меди и сульфата кобальт-аммония. Наиболее удобен раствор бихромата калия, так как он поглощает не только в ближней, ультрафиолетовой, но и в видимой области.

 

 

 

 

3.6 Отклонение от закона Ламберта - Бера

     Отклонения от закона Ламберта - Бера могут быть обусловлены различными изменениями с анализируемым веществом или относятся к недостаткам прибора. Нарушение закона иногда является результатом изменения концентрации растворенного вещества вследствие ассоциации между молекулами растворенного вещества или между молекулами растворенного вещества и растворителя, или вследствие ионизации, что часто зависит от природы растворителя.

     Ширина щели является одной из наиболее важных переменных величин в спектрофотометрии. Чистота (монохроматизм) излучения частично зависит от ширины щели. Относительная интенсивность полосы при любой длине волны будет неодинаковой; наивысшая интенсивность приходится на центр полосы и уменьшается к ее краям. Если входную щель уменьшить, относительная интенсивность становится более однородной. Однако нельзя уменьшать ширину щели бесконечно, существует предельная величина (оптимальная ширина щели), за которой любое уменьшение щели снижает интенсивность излучения. Центр полосы, имеющий максимальную интенсивность, называется средней длиной волны и является величиной, отмечаемой на шкале длин волн.

     Ширина щели имеет большое значение при анализе веществ с узкими адсорбционными полосами. Если используется слишком широкая щель, то существует возможность, что измерение будет выполнено при длинах волн на каждой стороне острого максимума («пика»), в связи с чем показание (величина) поглощения окажется низким.

     Имея в виду этот факт, Британская фармакопея указывает, что при измерении поглощения три максимуме адсорбции ширина спектральной щели должна быть меньше половины ширины полосы поглощения, иначе может быть ошибочно определена низкая величина поглощения. Особенно внимательно нужно относиться к измерениям таких веществ, как апоморфина гидрохлорид, хингамин, дийодгидроксихинолин, нафазолина нитрат, папаверина гидрохлорид и проциклидина гидрохлорид, которые имеют очень узкую полосу поглощения.

     При обычных рабочих условиях ширина полосы составляет от 1 до 5 нм на щель, что является удовлетворительным, за исключением узких максимумов.

     Возможные ошибки независимо от ширины щели вероятны в случае, если излучение источника и чувствительность фотоэлемента низкие, пропускаемость растворителя, кювет или призм неудовлетворительная вследствие старения, загрязнения, повреждения или если определение проводится на пределе возможной области.

     С призменными инструментами ширина полосы, соответствующая установленной ширине щели, не является постоянной по всей шкале волн, так как разрешение спектра изменяется с длиной волны и увеличивается с ее уменьшением. Настройка ширины щели не является необходимой для ряда приборов, в которых всегда используются условия максимальной чувствительности.

     Большинство спектрофотометрических измерений проводится в растворах. В качестве растворителей для области от 220 до 780 нм используются дистиллированная вода, метиловый, этиловый и другие спирты, диоксан, эфиры и низшие углеводороды. При выборе растворителя важно, чтобы он не поглощал в той же части спектра, что и растворенное вещество. Для получения спектроскопически чистых растворителей последние подвергают дополнительной очистке. Проба растворителей на отсутствие бензола может быть выполнена путем измерения поглощения в области от 230 до 265 нм, образцом для сравнения служит дистиллированная вода.

     Британская фармакопея определяет, что «при измерении поглощения раствора при определенной длине волны поглощение контрольной кюветы и растворителя не должно превышать 0,4 и в общем должно быть меньше чем 0,2, когда измеряется по отношению к воздуху при той же длине волны». Растворители должны быть свободны от флюоресценции, что может привести к возникновению эффекта рассеяния света и последующей ошибке при измерении.

     Структура и положение полос поглощения для ряда веществ зависят от природы растворителя. Полярные растворители, как правило, изменяют положение полос и упрощают их колебательную структуру.

     При сравнении двух кривых поглощения необходимо использовать один и тот же растворитель, поэтому в фармакопейном анализе указывают рН среды или растворитель, который используют в опыте.

     Отклонения от закона Ламберта - Бера могут быть также вызваны рассеянием света. Рассеяние света - это любое излучение, которое попадает в фотоэлемент, минуя раствор. Причинами возникновения рассеяния света могут быть неправильный выбор фильтров, слишком широкая полоса поглощения, установленная на приборе, а также сильное поглощение и флюоресценция растворителя.

      Вследствие недостатков оптической системы прибора небольшое количество рассеянного излучения может обычно присутствовать, однако оно возрастает по мере старения зеркал и источника излучения, что иногда приводит к получению ложного максимума. Такие максимумы обычно для предела ультрафиолетовой области около и ниже 220 нм, следовательно, показания ниже 220 нм нельзя считать достоверными, если не доказано отсутствие рассеянного света или его количеством можно пренебречь.

     Поправку на рассеяние света можно определить путем измерения поглощения для двух или более различающихся слоев, где поглощения должны быть в прямой зависимости от толщины слоя.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Глава 3. Инфракрасная спектрофотометрия

4.1 Основа метода

     Спектрофотометрия в инфракрасной области сравнительно недавно стала применяться в фармакопейном анализе. Она была впервые введена в ГФХ, Фармакопею США XVI, Британскую фармакопею 1963 г. и во Второе издание Международной фармакопеи.

     Известно, что молекулы вещества, независимо от его физического состояния и его природы, находятся в динамическом состоянии. Кроме переходов с одного уровня на другой, электроны колеблются вокруг и между двух или более положительно заряженных атомных ядер. Ядра в свою очередь сами движутся не только как целая единица, но и колеблются по отношению друг к другу, а также вращаются вокруг центра тяжести в молекуле. Все эти движения происходят с установленными частотами и характеризуются определенной величиной энергии.

     Выше отмечалось, что молекулы вещества могут поглощать различные виды световой энергии. В частности, энергия, необходимая для получения эффекта колебания, приходится на область от 0,5 до 25 мкм.

     Частота колебания молекулы или отдельной функциональной группы определяется геометрическим расположением всех атомов в молекуле, массой атомов, участвующих в движении, и прочностью в положении равновесия связи или связей, на которые оказано воздействие. Следовательно, любое вещество поглощает в инфракрасной области и лишь немногие вещества имеют поглощение в виде одной или нескольких полос.

     В целом спектры инфракрасного поглощения являются чрезвычайно сложными, так как определяются большой группой взаимозависимых факторов.

4.2 Инфракрасные спектрофотометры

    Приборы, применяемые в инфракрасной области, отличаются от ультрафиолетовых в отношении источников излучения, оптических материалов и детекторов.

     Источниками излучения в большинстве приборов являются лампы накаливания. Они представляют собой палочки карбида кремния (силитовый стержень - глобар) или очищенных окисей редкоземельных элементов - циркония, тория, иттрия (штифт Нернста). Оба элемента нагреваются электрически и при температуре 1200-2000° излучают радиацию с максимумом между 1,5 и 2,5 мкм, по типу радиации черного тела.

     Кварцевые и стеклянные призмы вследствие их сильного поглощения непригодны для работы в основной инфракрасной области, т. е. ниже 3,6 мкм. Здесь необходимо использовать ионные кристаллы, имеющие колебания низкой частоты.

     Невозможно использовать одну и ту же призму для всей инфракрасной области. Выбор призмы представляет собой компромисс между диспергирующей способностью и пропускаемостью призмы. Как, правило, призма становится наилучшим диспергирующим материалом при условиях наихудшей пропускаемости.

     На практике в большинстве приборов применяют призмы из хлорида натрия (каменная соль). Если необходима большая точность или избирательность, используют призмы из фторида лития или фторида кальция. Иногда призменное устройство комбинируют с дифракционной решеткой.

     Галоиды щелочных металлов должны быть защищены от высоких концентраций паров воды, в связи с чем следует проводить контроль температуры и влажности в лабораторном помещении.

     Как и в ультрафиолетовой области, здесь применяют систему зеркал. Чаще всего основной частью монохроматора является оптическое устройство (автоколлимационная схема Литтрова), в котором луч дважды проходит через призму и таким образом достигается двойное диспергирование.

     Исключительная сложность инфракрасных спектров обусловила создание регистрирующих автоматических приборов, являющихся в большинстве своем двухлучевыми.

     Инфракрасное излучение источника разделяется зеркалами на два луча, один из которых проходит через образец, а другой через контроль. Луч, выходящий из контрольного отделения, отражается на посеребренную часть прерывателя, а затем на другое зеркало. Прерыватель последовательно направляет энергию от образца, а затем от контроля через оптическую систему (монохроматор) к детектору для измерения. После прохождения щели энергия через сферическое зеркало натравляется на систему, состоящую из призмы и зеркала, которые медленно вращаются для обеспечения необходимой спектральной области. Луч дважды проходит через призму и затем через выходную щель попадает в детектор, который таким образом последовательно получает импульсы энергии, прошедшей через образец, и энергии, прошедшей через контроль.