Применение метода спектрофотометрии в видимой области в анализе лекарственных средств

1 мл раствора стандартного образца содержит 0,01 мг дипрофиллина.

     Расчет содержания вещества по стандартам не представляет особых трудностей. Как правило, построение калибровочного графика не является необходимым, так как ультрафиолетовые измерения, выполненные на современных приборах, практически всегда следуют закону Ламберта - Бера и одно измерение стандартного и исследуемого вещества обеспечивает точные результаты. При текущем анализе желательно время от времени проверять поглощения стандартных растворов для предотвращения ошибки вследствие неожиданных изменений характеристики спектрофотометра.

     Необходимо упомянуть способ расчета, принятый Скандинавской фармакопеей. Содержание вещества в испытуемом препарате определяют по формуле:

где q - концентрация стандарта  в миллиграммах на 100мл раствора;

b - процентное содержание чистого вещества в стандарте;

р - концентрация испытуемого  вещества в милиграммах на 100 мл;

К1 - разница в поглощении стандартного раствора, измеренного  к контрольному раствору;

К2 - разница в поглощении стандартного раствора, измеренного к испытуемому раствору.

     Второе издание Международной фармакопеи не указывает способа расчета содержания вещества.

     Рассчитывают содержание вещества по величине поглощения, полученной со стандартным образцом, определенной при условиях опыта.

     Рассмотренные до сих пор методы спектрофотометрических количественных определений относились к анализу одного компонента при условии отсутствия поглощающих примесей в области максимума и при условии, когда расчет поправки на дополнительное поглощение не представляет специальной проблемы.

     Однако поправку на примеси следует определять, если спектрофотометрически анализируются природные извлечения или сложные смеси. Существует несколько способов установления поправок в зависимости от характера кривой поглощения и примесей.

     Один из (них, известный под названием способа Мортон - Стаббса, используется в фармакопейном определении ретинола (витамина А). Линейная зависимость содержания поглощающих примесей по отношению к длине волны является основным условием для расчета поправки по способу Мортон - Стаббса. Поглощение измеряют в трех точках спектра таким образом, что второе измерение приходится на максимум поглощения. Остальные величины поглощения при двух длинах волн равны между собой и составляют определенную часть поглощения при максимуме; эта последняя рассчитывается по результатам, полученным для чистого вещества.

     Метод спектрофотометрического определения витамина А рекомендован Международным союзом теоретической и прикладной химии в 1956 г. и принят большинством фармакопей.

     Метод. Все процедуры должны проводиться быстро, насколько это возможно, следует принимать меры во избежание воздействия света и окислительных агентов.

     Так как положение максимума поглощения является важным критерием и поправочные уравнения требуют измерений при точных длинах волн, необходимо, чтобы шкала длин волн спектрофотометра была проверена немедленно перед определением. Ртутные линии при 313,16 и 334,15 нм являются подходящими точками и для удобства настройка прибора по этим линиям может быть связана с его настройкой по водородным линиям при 379,7 и 486,1 нм. Точность исправленного поглощения значительно ниже, чем три непосредственно измеренных поглощения, из которых оно рассчитывается; следовательно, измерения требуют особой осторожности и следует проводить не менее двух количественных определений.

     Витамин А в форме эфира. Образец, нерастворимый непосредственно В циклогексане, может быть обработан экстракцией или другими средствами, не связанными с омылением. Если это невозможно, поступают так, как описано в разделе «Другие формы витамина А».

     Растворяют точно взвешенное количество образца или приготовленного извлечения в достаточном количестве циклогексана для получения раствора с содержанием от 9 до 15 Международных единиц в миллилитрах. Определяют длину волны максимума поглощения. Измеряют поглощения при длинах волн, приведенных в табл., и рассчитывают их как отношение к поглощению при 328 нм.

Таблица

Длина   волны  (в  нм )	Относительное  поглощение
300	0,555
316	0,907
328	1,000
340	0,811
360	0,299

 

     Рассчитывают также поглощение при 328 нм в виде Е(1%, 1 см) или в виде «а» - поглощаемость.

     Если максимум поглощения лежит между 326 и 329 нм и наблюдаемые относительные поглощения находятся в пределах 0,02 от указанных в таблице, определяют активность образца в Международных единицах и в граммах по формуле:

Е(1%, 1 см)328 * 1900.

     Если максимум поглощения лежит между 326 и 329 нм, но относительные поглощения не находятся в пределах 0,02 от указанных в табл. 2, рассчитывают исправленное поглощение при 328 нм, применяя найденные показания в уравнении:

А328 (испр.) = 3,52 (2A328 - А316 - А340).

     Если исправленное поглощение лежит в пределах -15% или +3% неисправленного поглощения, активность рассчитывают по исправленному поглощению.

     Если исправленное поглощение лежит вне -15% или +3% неисправленного поглощения или максимум поглощения не приходится на область 326 и 329 нм, образец подвергают анализу, как это описано в разделе «Другие формы витамина А».

     Другие формы витамина А. Смешивают точно взвешенное количество образца, содержащего не менее 500 Международных единиц витамина А и не более 1 г жира с 30 мл безводного спирта и 3 мл 50% раствора едкого кали, кипятят с обратным холодильником в течение 30 минут, под током азота, свободного от кислорода, быстро охлаждают и прибавляют 30 мл воды. Переносят гидролизат в делительную воронку с помощью трех количеств, каждое 50 мл, эфира и извлекают витамин А встряхиванием в течение минуты. После полного разделения слоев отбрасывают водный слой и промывают извлечение четырьмя порциями, каждая 50 мл, воды смешивая осторожно во избежание образования эмульсии во время первых двух промываний. Упаривают определенный экстракт до 5 мл и удаляют оставшийся растворитель в токе азота, свободного от кислорода, без применения нагревания. Растворяют остаток в достаточном количестве изопропилового спирта для получения раствора с содержанием от 9 до 15 Международных единиц в 1 миллилитре и измеряют поглощения при 300, 310, 325 и 334 нм. Определяют длину волны максимума поглощения.

     Если максимум поглощения лежит между 323 и 327 нм и отношение поглощения при 300 им к поглощению при 325 нм не превышает 0,73, получают исправленное поглощение по уравнению:

A325 (испр.) =6,815 А325 - 2,555 А310 - 4,260 А334.

     Активность образца в Международных единицах в граммах рассчитывают по формуле:

Е325 (испр.) * 18300,

за исключением случая, когда исправленное поглощение лежит  в пределах ±3,0% неисправленного  поглощения, исправленным поглощением  можно пренебречь, и активность рассчитывают по неисправленному поглощению.

     Если максимум поглощения лежит вне области 323 до 327 им или отношение поглощения при 300 им к поглощению при 325 им превышает 0,73, неомыленную часть образца нужно подвергать хроматографированию.

     При выполнении спектрофото метрического анализа витамина А следует принимать во внимание, что растворы ретинола исключительно чувствительны по отношению к свету.

     В качестве растворителей применяются петролейный эфир, циклогексан, изопропиловый спирт и реже хлороформ. Чаще всего предпочитают циклогексан, так как спектральные различия в области 310 до 315 нм между нео- и транс-витамином А менее проявляются в этом растворителе. Растворители подвергают дополнительной очистке путем перегонки; рекомендуется также проверять их спектральную чистоту в области от 300 до 350 нм.

      Согласно ГФХ, содержание ретинола определяют в индивидуальном веществе спектрофотометрически при 326 нм в растворе в абсолютном спирте. Предварительно проводят испытание на поглощающие примеси. Расчет производят принимая 1550 за величину Е (1%, 1 см) для 100% ретинола при длине волны 326 нм.

     Фармакопея США XVII указывает, что при условиях определения (поглощение измеряют после омыления) следует ожидать расхождения в данных, полученных различными лабораториями при Р = 0,05 около ±8%.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.4 Инфракрасные спектры поглощения и их применение для идентификации лекарственных веществ

     Оценка инфракрасных спектров поглощения является более сложной, чем ультрафиолетовых, вследствие большого числа полос, что в то же время составляет основу идентификации вещества.

     Для интерпретации спектров обычно используют имеющиеся данные о связи между инфракрасными полосами поглощения и структурными элементами молекул. Такие данные сводятся, как правило, в виде корреляционных таблиц-диаграмм.

     В области от 2,5 до 6,5 мкм с помощью таблиц по сильному и среднему поглощению можно с определенной точностью идентифицировать определенную функциональную группу. Инфракрасные полосы поглощения, соответствующие валентным колебаниям С-Н, находятся в области 3,3 мкм, для алифатических соединений характерные полосы лежат от 3,3 до 3,7 мкм; для ароматических веществ - от 3,2 до 3,3 мкм. Свободная гидроксильная группа будет иметь слабую, но четко выраженную полосу при 2,75 мкм, водородная связь значительно увеличит ее интенсивность и вызовет смещение полости до 2,85 или до 3,0 мкм.

     Наличие полос валентных колебаний =С - Н при 3,3 мкм и колебаний в области от 6,1 до 6,25 мкм указывает на присутствие вещества, имеющего структуру ароматического типа. Положение полос поглощения определенной функциональной группы не является постоянным в применении к разным молекулам вследствие влияния соседних атомов и групп. Например, положение карбонила, С = 0, при 5,75-5,8 мкм, характерно для альдегидов и кетонов; при 6,0 - 6,1 мкм - для кислот; при 5,75 - 5,85 мкм - для эфиров; ангидриды имеют две полосы поглощения: при 4,9 - 5,05 мкм и при 5,60 - 5,75 мкм.

      Ниже 6,25 мкм, однако, соотношение между характерными частотами диаграммы и наблюдаемыми при опыте частотами не соблюдается, так как в этой области проявляются характеристики не отдельных функциональных групп, а всей молекулы. Это явление объясняется частично тем, что здесь существует много полос для большинства молекул и что нет простого способа установления соответствия полос поглощения определенным колебаниям и положение полос в большей мере подвергается непредусмотренным изменениям. Прежде всего зависимость характера спектра поглощения от строения определенной молекулы может быть связана с фактом, что существуют многие колебания, имеющие приблизительно одинаковую частоту, и что эти колебания взаимодействуют друг с другом.

     Область от 8 до 15 мкм носит иногда название области «отпечатков пальцев» (finger print), так как именно эта часть спектра обусловливает уникальность спектра отдельного вещества.

     Существует несколько возможностей описания фармакопейных испытаний на подлинность посредством инфракрасных спектрофотометрических измерений.

      Прежде всего это издание сборников инфракрасных спектров для веществ, включенных в фармакопею, с тем, чтобы впоследствии эти спектры использовались для сравнения с соответствующим спектром исследуемого вещества. Коллекции инфракрасных спектров постоянно публикуются и расширяются. Описаны спектры стандартных веществ, включенных в Фармакопею США XVI.

     Другую возможность представляет указание длин волн, при которых наблюдаются полосы поглощения, и выражение их интенсивности как сильной, средней, слабой и переменной.

      Инфракрасные спектры, являясь уникальным средством идентификации вещества, в то же время, как было показано выше, подвержены влиянию многих факторов. Спектры могут быть разными у двух различных спектроскопистов. Качество растворителей, условия приготовления образца для анализа, кристаллические формы вещества составляют краткий перечень факторов, влияющих на спектр. В связи с этим в фармакопейном анализе основным правилом для инфракрасной идентификации является получение спектра стандартного вещества в то же время и при тех же условиях, что и спектр образца, с последующим сравнением двух спектров.

     Британская фармакопея 1968 г. и Международная фармакопея Второго издания описывают определение инфракрасного поглощения для установления подлинности стероидов, гликозидов и полусинтетических пенициллинов. В разделе общих методов анализа излагаются методики измерений в виде взвеси и в виде дисперсии со щелочным галоидом.

     В Государственную фармакопею X издания впервые включена инфракрасная спектрофотометрия для анализа натриевых солей метициллина и оксациллина и фторотана (галотана).

     Инфракрасный спектр препарата имеет те же максимумы поглощения, что и стандартный образец натриевой соли метициллина (Метициллина натриевая соль, ГФХ).

     Идентификация органических оснований по инфракрасному спектру в растворе сероуглерода является общим методом Фармакопеи США XVII.

     Растворяют 50 мг вещества в 25 мл воды или взбалтывают эквивалентное количество порошка таблеток или содержимого капсул с 25 мл 0,01Н соляной кислоты в течение 10 минут. Переносят жидкость в делительную воронку, фильтруя, если необходимо, и промывая фильтр и остаток небольшими порциями воды. Во второй делительной воронке растворяют 50 мг стандарта в 25 мл воды. Затем каждый раствор обрабатывают следующим образом: прибавляют 2 мл 10% раствора едкого натра и 4 мл сероуглерода и встряхивают в течение 2 минут. Центрифугируют, если необходимо сделать прозрачной нижнюю фазу, и фильтруют ее через сухой фильтр, собирая фильтрат в небольшую колбу с притертой пробкой. Определяют спектры поглощения обоих отфильтрованных растворов без задержки, в кювете 1 мм в области от 7 до 15 мкм в подходящем спектрофотометре, применяя в качестве контрольного раствора сероуглерод. Спектр раствора, полученный из образца, имеет все важнейшие полосы поглощения, что и раствор стандарта. Если спектр образца имеет полосы, отличающиеся от стандарта, образец может быть подвергнут очистке и опыт повторен.