Применение метода спектрофотометрии в видимой области в анализе лекарственных средств

     Иногда величину поглощения выражают в виде удельного показателя поглощения, Е (1%, 1 см).

     Удельный показатель поглощения, Е (1 %, 1 см), при длине волны 278 нм 290-305 (0,002% водный раствор) (Левомицетин, ГФХ).

     Если кривая поглощения изменяется в зависимости от pH раствора, указывают значение pH, при котором проводится измерение.

     Ультрафиолетовый спектр раствора в фосфатном буфере, pH 7,5, имеет максимум только при 252 нм, поглощение 0,0005 раствора при толщине слоя 1 см около 0,4 (Сульфафуразол, Международная фармакопея, Второе издание).

     Раствор в 0,01 н. едком натре имеет максимум при 326 нм, Е (1%, 1 см) - около 65, и минимум при 294 нм, Е (1%, 1 см) - около 35.

     Раствор в смеси 10 объемов 0,1Н соляной кислоты и 40 объемов 95% спирта, доведенных водой до 100 мл, имеет максимум при 300 нм, Е (1%, 1 см) - около 50, и минимум при 275 нм, Е (1 %, 1 см) - около 40 (Левотироксин-натрий, Скандинавская фармакопея).

     Некоторые фармакопеи вместо абсолютных величин поглощения принимают отношение адсорбции при максимуме к абсорбции при минимуме, что дает возможность до некоторой степени судить о наличии поглощающих примесей.

001 % раствор препарата  в 0,1Н растворе едкого натра  имеет максимумы поглощения при  256, 283 и 365 нм. Отношение D при 256 нм к D при 365 нм составляет 2,8-3,0 (Фолиевая кислота, ГФХ).

     Для феноксиметилпеннцииллина по той же фармакопее проводят измерение следующим образом.

     Около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в 4 мл 5% раствора гидрокарбоната натрня, разводят водой до 500 мл и определяют оптическую плотность (D) при длине волны 268 нм и при длине волны 274 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Контрольным раствором служат 4 мл 5% раствора гидрокарбоната иатрия, разведенные водой до 500 мл.

     Отношение D при длине волны 268 нм к D при длине волны 274 им должно быть не менее 1,21 и не более 1,24.

     В случае стандарта идентификация веществ сводится к сравнению двух спектров поглощения, полученных при одних и тех же условиях.

     Ультрафиолетовый спектр 0,0005% раствора в спирте имеет максимумы и минимумы яри тех же длинах волн, что н раствор стандарта, одинаковой концентрации и одновременно измеренный; соответствующие величины поглощения, рассчитанные на сухое вещество, при максимуме поглощения около 281 нм не отличаются более чем на 3% (Эгинилэстрадиол, Фармакопея США XVII).

     Последний метод обеспечивает наиболее достоверные результаты и должен быть рекомендован для фармакопейных испытаний на подлинность.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.2 Испытание на чистоту спектометрией в ультрафиолетовом спектре

     Метод спектрофотометрии в ультрафиолетовой области успешно используется как для идентификации и количественного определения, так и в испытаниях на чистоту.

     Применение ультрафиолетовой спектрофотометрии для проверки доброкачественности фармакопейных препаратов является наиболее ценным в случаях, когда примеси или продукты разложения поглощают в области, отличной от исследуемого вещества. Таким образом определяют содержание адреналона, имеющего максимум при 310 им, в адреналине, максимум поглощения при 278 нм.

     Указываемые в фармакопейных статьях величины поглощения, определяющие предельное содержание примеси как «не более...», устанавливаются эмпирическим путем.

-оксифенилтриметиламмоний  бромид, сопутствующий йеостигмину бромиду, имеет максимум при 294 нм.

     Поглощение 0,05% раствора в 0,1М карбонате натрия при 294 нм не более 0,03 - предел содержания 3 мг на 1 г (Неостнгмнн бромид, Скандинавская фармакопея).

     Аналогично определяется содержание гитоксина в дигитоксине по Международной фармакопее Второго издания.

     Растворяют около 5 мг препарата (точная навеска) в 1 мл метилового спирта и доводят глицерином или концентрированной соляной кислотой до объема 25 мл. Поглощение этого раствора после часа стояния при 352 нм около 0,28 (не более 5%).

     Предел содержания поглощающих примесей может быть установлен по величине отношений абсорбций при различных максимумах. При анализе циаиокобаламина по Государственной фармакопее X издания определяют оптическую плотность (D) раствора, приготовленного для количественного определения в кювете с толщиной слоя 1 см при длинах волн 278, 361 и 548 нм.

Отношение D при 361 нм к D при 548 нм должно быть от 3,0 до 3,4.

Отношение D при 361 нм к D при 278 нм должно быть от 1,7 до 1,88.

     Изучение ультрафиолетовых спектров является ценным при испытаниях на чистоту и при исследованиях стабильности лекарственных средств, если изменения в характере спектра позволяют судить об изменениях и превращениях вещества.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.3 Количественное определение спектометрией в ультрафиолетовом спектре

     Спектрофотометрия в ультрафиолетовой области широко используется для количественного определения лекарственных веществ и их препаратов и включена во все современные фармакопеи.

     Идеальное вещество для таких измерений должно иметь четко выраженную полосу поглощения с широким максимумом (для уменьшения ошибки за счет ширины щели) и со значительной величиной поглощения при максимуме.

     Чувствительность анализа определяется в основном способностью вещества поглощать свет и выражается, как было указано выше, молярным коэффициентом поглощения. Предельные концентрации веществ, анализируемые при помощи спектрофотометрии, как правило, меньше, чем при обычных и потенциометрических титрованиях или весовых измерениях, что и объясняет тот факт, что спектрофотометрия используется при определении небольших количеств веществ.

     Основным условием для количественного анализа является соблюдение закона Ламберта - Бера в пределах указанных концентраций. Для проверки соответствия закону строят график зависимости: поглощение - длина волны, если все точки лежат на прямой - закон выполняется. Точность метода будет зависеть от наклона прямой: чем больше наклон, тем выше точность.

     По другому способу рассчитывают фактор для каждого стандартного раствора и определяют область концентраций, в пределах которой величина D/С остается постоянной.

     Известны два принципиально различных способа спектро-фотометрических количественных определений. По одному из них содержание вещества рассчитывают на основании предварительно вычисленной величины поглощения.

      Британская фармакопея 1968 г. приняла этот метод определения как для лекарственных веществ, так и для лекарственных форм.

     Растворяют около 10 мг (точная навеска) в безводном спирте и доводят спиртом до 100 мл, разводят 5 мл полученного раствора до 50 мл безводным спиртом и измеряют поглощение полученного раствора в кювете с толщиной слоя 1 см при 240 им Е (1%, 1 см) для С20Н30О2 при максимуме около 240 нм - 535 (Метилтестостерэн).

     Государственная фармакопея СССР X издания следующим образом рекомендует определять кортизона ацетат в таблетках.

     Около 0,1 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляют 60-70 мл 95% спирта и растворяют при легком подогревании на водяной бане прн помешивании в течение 10-15 минут. По охлаждении раствор доводят до метки 95% спиртом, хорошо перемешивают и дают отстояться в течение часа. Не взмучивая осадка, 5 мл раствора переносят в другую мерную колбу емкостью 100 мл и доводят тем же спиртом до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 238 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см. В контрольную кювету помещают спирт.

Содержание кортизона  ацетата в граммах вычисляют  по формуле:

где D-оптическая плотность  испытуемого раствора;

- удельный показатель  поглощения кортизона ацетата Е (1%, 1 см) при 238 нм;

а - навеска препарата  в граммах;

б - средний вес таблетки в граммах.

     Количественное определение по описанному выше методу подвергается постоянной критике. Основной причиной для этого является общеизвестный факт, что различные спектрофотометры (даже различные приборы одной и той же модели и одного производства) дают значительные отклонения по величине поглощения для одного и того же стандартного раствора.

     Более правильным способом является сравнение поглощения испытуемого вещества с поглощением стандартного образца, определенного в тех же условиях. Таким образом достигается наибольшая точность, так как при этом учитываются многочисленные факторы, влияющие на спектрофотометрические измерения, как, например, установка длины волны, ширина щели, поглощение кюветы, поправки на поглощение растворителя и т. д.

     Многие методы физико-химического анализа лекарственных средств связаны со сравнительной оценкой испытуемого препарата по отношению к веществам, химический состав которых отличается постоянством и может быть установлен с необходимой точностью. Такие вещества называют стандартными образцами. Выражение «стандарт» особенно часто применяется в биологических методах анализа. Однако в связи с тем, что термин одновременно применяют и для обозначения технической документации (ГОСТ), представляется более правильным называть все вещества, используемые для сравнения при определении качества, стандартными образцами.

     Как вытекает из самого определения, вопросы чистоты вещества приобретают основное значение при разработке стандартных образцов. Некоторыми фармакопеями (Фармакопея США XVII) во всех случаях качественного или количественного спектрофотометрического определения рекомендуются специально приготовленные стандартные образцы, в связи с чем общее число таких веществ в Фармакопее США превышает 150. Однако число специально приготовленных стандартных образцов может быть ограничено за счет использования в качестве их веществ, отвечающих требованиям фармакопеи. Некоторые интересные принципиальные положения в этом отношении приняты Государственной фармакопеей СССР X издания, Международной фармакопеей Второго издания и Скандинавской фармакопеей.

     В частности, при количественном спектрофотометрическом определении индивидуальных веществ эти фармакопеи рекомендуют применять специально приготовленные стандартные образцы. При расчете количественного содержания определяемого вещества по ГФХ и Международной фармакопее, если нет специального указания, стандартный образец принимают за 100%; по Скандинавской фармакопее учитывают фактическое содержание чистого вещества в стандартном образце, что, по-видимому, следует делать лишь при содержании чистого вещества ниже 97, например при анализе некоторых витаминных препаратов.

     Следующий текст используется в статьях X издания Государственной фармакопеи при анализе индивидуальных веществ.

     Измеряют оптическую плотность 0,001 % раствора препарата в 95% спирте на спектрофотометре при длине волны 241 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Повторяют такое же измерение с 0,001% раствором стандартного образца прегнина.

     Содержание прегнина в процентах (X) вычисляют по формуле:

где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора стандартного образца; С1 - концетрация испытуемого раствора; С0 - концентрация раствора стандартного образца.

     Содержание С21Н28О2 в препарате должно быть не менее 97% и не более 103,0% (Прегнин).

     При количественном определении лекарственных форм, если нет специальных указаний, стандартным образцом служит вещество, отвечающее всем требованиям фармакопеи. При расчетах стандартный образец принимают за 100%. По Международной фармакопее при спектрофотометрическом анализе лекарственных форм в качестве стандартного вещества применяют вещество, определяемое по фармакопее объемным, весовым или другими, но не спектрофотометрическими методами. Так как в ряде случаев этого требования может быть недостаточно, во Второе издание Международной фармакопеи включена оговорка о возможном применении для анализа лекарственных форм специального стандартного образца.

     Методика количественного определения дипрофиллина в таблетках дипрофиллина по ГФХ.

     Около 0,12 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу емкостью 100 мл, прибавляют небольшое количество воды, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют, 1 мл фильтрата переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 273 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

     Параллельно проводят измерение оптической плотности раствора стандартного образца дипрофиллина.

     Содержание дипрофиллина в одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

 

где D1 - оптическая плотность  испытуемого раствора;

D0 - оптическая плотность  раствора стандартного образна; 

а - навеска в граммах;

б - средний вес таблетки в граммах.

     Содержание С10Н14О4 должно быть 0,19-0,21, считая на средний вес одной таблетки.

     Примечание. Приготовление раствора стандартного образца дипрофиллина. 0,1000 г стандартного образца дипрофиллина растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.