Санитарно – бактериологическое исследование качества питьевой воды

Оптимальная площадь для рабочих мест в комнатах  составляет  12 м2, высота 3 м. Лаборатория  имеет хорошее естественное освещение, вентиляцию, канализацию, водопровод.

Комната для микроскопирования  самая светлая, с большими оконными проемами. Стены внутри лаборатории окрашены масленой краской в светлые тона, что позволяет их дезинфицировать. Потолки в лаборатории окрашены в белый цвет. Пол покрыт специальной плиткой прочного действия.

Перед входом в микробиологическую лабораторию находится коврик, обработанный антисептиком. Рядом с входной дверью находится шкаф со стерильной санитарной одеждой и обувью.

Основным оборудованием микробиологической лаборатории являются:

1. термостаты
2. микроскопы (различные)
3. автоклав
4. шкаф для стерилизации сухим жаром
5. водяная баня
6. холодильник для хранения питательных сред
7. аппарат для дистилляции воды
8. центрифуги

Для микробиологических исследований молочных продуктов и проведения санитарно – бактериологического контроля условий производства применяют натуральные (приготовленные из продуктов животного и растительного происхождения) плотные и жидкие питательные среды. Кроме того, для приготовления разведений исследуемого материала используют стерильную воду, содержащую поваренную соль

(Приложение  №1).

 

3. Практическая работа: санитарно-бактериологическое исследование качества питьевой воды Бугульминского водоканала.

 

Выполнение микробиологических анализов

 

В схему описания признаков микробов, подлежащих определению, включаются их морфологические, культуральные и биохимические признаки.

Микробы изучались на основании наблюдений под микроскопом; при этом основное внимание сосредотачивалось на следующем: форма клеток и колоний, наличие или отсутствие подвижности, отношение к окраске по Граму, наличие спор или отсутствие их.

Культуральные признаки слагаются из особенностей роста микробов на питательных средах.

 

Посев штрихом

На косой агар посев штрихом производился для освежения тех штаммов коллекционных и рабочих культур микроорганизмов, которые выращиваются и сохраняются на твердых агаровых средах. Пробирку с косым агаром помещали в наклонном положении между большим и указательным пальцами левой руки, вынимали пробирку и, взяв посевной материал из намеченной колонии предварительно прокаленной иглой,  вводили ее внутрь пробирки. Иглу опускали почти до конденсационной воды, и, слегка касаясь агара, проводили прямую или зигзагообразную черту через всю его поверхность.

После посева иглу вынимали из пробирки и обжигали вместе с остатками посевного материала; затем обжигали края пробирки и закрывали ее предварительно обожженной пробкой.

Посев уколом

Рост по уколу в агар дает возможность установить потребность микробов в воздухе. В зависимости от того, требуются ли для развития микробов воздух или нет, меняется и характер роста их в питательной среде. Рост по уколу в желатин также характеризует отношение микробов к воздуху.

По разжижению желатина можно наблюдать и протеолитическую способность микробов. Взятый обожженной иглой посевной материал быстро вводили в пробирку с твердой питательной средой (агаром или желатином). Затем, медленно прокалывая среду, доводили иглу почти до самого дна пробирки. Необходимо чтобы игла проходила посредине. После посева иглу медленно вынули, края пробирки обожги, а пробирку закрыли обожженной пробкой.

При посеве уколом пробирку со средой рекомендуется держать в перевернутом положении. Подняв пробирку на уровне глаз, делают укол снизу вверх; при таком способе иглу можно точно направлять посредине пробирки, так как хорошо видно ее движение в пробирке.

Посев в чашке Петри

Этот посев дает возможность изучать форму и величину поверхностных и глубинных колоний.

Поверхностный посев. Чашки Петри заливали агаром и после застывания подсушивали в термостате. Затем петлей или при помощи пипетки исследуемый материал нанесли на поверхность агара первой чашки и растирали стерильным шпателем круговыми движениями по всей поверхности питательной среды (крышку чашки Петри при этом слегка приоткрывают). Посев на первой чашке обычно бывает слишком густым и малопригодным для выделения чистой культуры. Чтобы получить изолированные колонии, делали посев на вторую и третьи чашки. Для этого шпатель вынули из первой чашки, не обжигая, перенесли его во вторую и растерли оставшийся посевной материал на поверхности агара; затем шпатель перенесли в третью чашку, в которой заканчивают посев.

Глубинный посев осуществляется следующим образом. В левую руку берут пробирку со стерильной водой и помещают ее между большим и указательными пальцами; держа пробирку наклонно (чтобы предохранить ее от загрязнения микробами из воздуха), вынули пробку и поместили ее между указательным и средним пальцами левой руки и захватили мизинцем правой руки.

Затем берем петлю и, держа ее вертикально, медленно проводим через пламя горелки (петля должна при этом накалиться), обжигая не только петлю, но и часть держателя. Непосредственно после обжигания петлю вводим в сосуд с посевным материалом; дав петле несколько остыть, захватываем материал и быстро переносим его в пробирку со стерильной водой (края ее перед этим слегка обжигают над пламенем горелки). Петлю опускаем в воду и несколько раз встряхиваем; затем ее быстро вынимаем и обжигаем, а пробирку закрываем ватной пробкой, предварительно обожженной на огне.

Материал, внесенный в стерильную воду, тщательно размешиваем встряхиванием пробирки или вращением ее между ладонями. Полученное разведение материала обычно не используют для посева вследствие большого количества содержащихся в нем клеток микробов. Необходимо приготовить еще большее разведение, посев которого даст на чашке изолированные колонии микробов.

Для этой цели берем вторую пробирку со стерильной водой и помещаем ее рядом с первой в левой руке, то есть между указательным и средним пальцами. Держа пробирки наклонно, вынимаем пробирки и помещаем одну между средним и безымянным пальцами, а вторую – между безымянным и мизинцем. Как и в предыдущем случае, фламбируют края пробирок и обожженной петлей быстро переносим после перемешивания материала из первой пробирки во вторую. После этого пробирки закрываем предварительно обожженными на огне пробками.

Из полученного таким образом вторичного разведения материала можно делать посев в питательную среду.

Если же материал мало изучен, можно произвести еще одно разведение, то есть перенести материал из второй в третью пробирку со стерильной водой. В этом случае посев в питательную среду следует производить отдельно из каждой пробирки.

Перед посевом питательную среду расплавляют. Если для этого используют агар, то его расплавляем в кипящей воде; желатин легко расплавляется в теплой воде и при легком нагревании над пламенем горелки.

Затем подготавливаем чашки Петри; для этого развертываем бумагу, в которой они стерилизовались, и осторожно кладем их на стол, стараясь не раскрывать (в противном случае будет нарушена стерильность).

Посев осуществляется следующим образом. Пробирку с расплавленным агаром охлаждаем до 45 – 50 °С (пробирки с желатином охлаждать не требуется, так как он расплавляется при более низкой температуре). Затем в одну из пробирок предварительно обожженной петлей вносим материал из первой пробирки со стерильной водой, в которой заранее было подготовлено разведение. Таким же образом делаем посев из пробирок со вторым и третьим разведением. Материал, внесенный в пробирку с расплавленной питательной средой, для равномерного распределения микробов тщательно перемешиваем легким вращением пробирки между ладонями, избегая образования пузырьков, и быстро выливаем в чашку Петри.

Эту операцию выполняем следующим образом. Вынув пробирку, нужно пломбировать края пробирки и быстро вылить содержимое, осторожно приподняв крышку чашки. Все это необходимо делать быстро, так как агар может застыть, но следует избегать излишней поспешности. При использовании желатина нет необходимости ускорять операцию посева, так как желатин застывает очень медленно.

После выливания питательной среды нужно еще раз тщательно перемешать ее для равномерного распределения микробов. Это достигается легким наклонением чашки Петри в разные стороны (наблюдать, чтобы среда не попала на крышку).

Подобного рода посевы делают из всех пробирок, которые по расчетам могут дать количество колоний, позволяющее выделить чистые культуры.

После посева среде даем застыть – агар застывает быстро, желатин гораздо медленнее; затем чашки с агаром переворачиваем вверх дном и помещают в термостат. При посеве на желатин чашки не переворачиваем; их можно оставлять при комнатной температуре или выдержать в термостате при 20 – 22 °С.

Выращивание

Микробов необходимо выращивать при оптимальной температуре. В этом отношении требование микробов довольно разнообразно. Так, у патогенных микробов оптимальная температура находится в пределах 37 – 39 °С, у большинства сапрофитов – около 30 – 35 °С. Однако среди последних отдельные виды предпочитают более высокую (40 – 50 °С и выше) или более низкую (20 – 25 °С) температуру.

Для образования колоний, пригодных по своей величине для выделения чистых культур, обычно бывает достаточно 1 – 3 дней.

Выделение чистой культуры

Чистую культуру надо выделять после окончательного оформления колоний. Из засеянных чашей Петри выбираем те, в которых имеются отдельные, хорошо изолированные друг от друга колонии.

Выделяемый микроб можно засевать на твердую среду и в жидкую питательную среду.

Для этого обожженной над пламенем горелки иглой слегка прикасаемся к колонии и, захватив материал, переносят его в пробирку с косым агаром или жидкой средой.

Для характеристики физиологических свойств микробов нужно иметь следующие данные.

Устанавливают оптимальную температуру роста микробов и крайние пределы их развития.

Способность к сбраживанию различных углеводов является характерной особенностью микроорганизмов. В результате развития в среде микробов можно наблюдать образование или отсутствие кислоты, образование или отсутствие газа.

Чашечный метод учета микрофлоры

При данном методе количество микробов в продукте определяли по количеству выросших на среде колоний, предполагая, что каждая колония образуется из одной клетки. Определенное количество исследуемого материала вносят в чашку Петри и заливают питательной средой. Твердые продукты предварительно превращают в жидкое состояние.

Для посева на чашке используют три последних разведения, рассчитывая, что на чашке с наиболее густым разведением вырастет приблизительно 1000 колоний, на предпоследней – 100 и на последней – 10 колоний. Площадь чашки Петри позволяет подсчитывать колонии с достаточной степенью точности, если количество колоний не превышает 500.

Чтобы получить разведение в 10 раз (первое разведение), пробирку с используемым материалом помещаем в наклонном положении в левую руку между большим и указательным, а пробирку со стерильной водой – между указательным и средним пальцами. Пробирки из пробирок вынимаем и помещаем одну между средним и безымянным пальцами левой руки, а другую захватываем мизинцем правой руки. Затем, обжигая над пламенем горелки концы пробирок, вводим стерильную пипетку в пробирку с исследуемым материалом, набираем 1 мл и переносим его в пробирку со стерильной водой. Жидкость выдуваем, несколько раз вновь набираем стерильную воду и таким образом промывают пипетку. После этого пробирки закрывают пробками, предварительно обожженными на огне.

Если необходимо приготовить дальнейшие разведения, берем новую стерильную пипетку и, набирая 1 мл из пробирки с первым разведением, переносим его во вторую пробирку со стерильной водой; получается разведение в 100 раз (второе разведение).

Все последующие разведения готовятся подобным же образом.

После того, как будут приготовлены необходимые разведения, начинаем посев в чашки. Для этого берем 3 чашки Петри и в каждую из них вносят стерильной пипеткой по 1 мл намеченного разведения, слегка приоткрывая крышку и выдувая все содержимое пипетки.

Посевы обычно начинают с посевного разведения; при этом можно пользоваться одной пипеткой, так как посев производят от редкого к более густому разведению.

Исследуемый материал после внесения в чашки Петри заливаем питательной средой; для более равномерного распределения клеток микробов чашку непосредственно после выливания питательной среды несколько раз осторожно наклоняем в разные стороны.

После застывания агара чашку переворачиваем кверху дном и помещаем в термостат.

Колонии подсчитываем через 2 – 3 дня; чашки с числом колоний менее 10 не учитываем. Микробы можно выращивать и при другой температуре в соответствии с требованиями работы.

При наличии большого числа колоний для удобства подсчета дно чашки расчерчиваем на секторы и подсчитываем колонии в каждом секторе отдельно. Результаты, полученные при подсчете отдельных секторов, суммируем и, умножая полученное число на разведение, определяем количество микробов в 1 мл посевного материала.

Для получения более точных результатов колонии следует подсчитывать на трех чашках и брать средние цифры.

Посев в пробирки

При недостатке чашек Петри их можно заменить пробирками несколько большего размера, чем обычные. Из приготовленных разведений исследуемого материала в стерильной воде делают посевы в пробирки с расплавленной и охлажденной до 45 °С питательной средой.