Дослідження ролі стафілококів у розвитку гнійно-запальних процесів

Стафілококи — факультативні анаероби, лише один вид (S. saccharolyticus) – облігатний анаероб, хемоорганотроф. Невимогливі до поживних середовищ, добре ростуть на звичайних середовищах, в тому числі на середовищах з 5-10% NaCl, або 40% жовчі.

Якщо патогенні  форми вирощувати на кров'яному агарі, то навколо колоній утворюються зони гемолізу. Температурний оптимум для росту 35-37С, рН 6,2-8,4. При вирощуванні в аеробних умовах стафілококи потребують амінокислоти та вітаміни для росту, а в анаеробних умовах, крім того, їм необхідний урацил. Колонії круглі, 2 – 4 мм у діаметрі, з рівними краями, опуклі, непрозорі, пігментовані (кремовий, жовтий, оранжевий пігмент). Колір пігменту колоній може бути різний у різних штамів одного і того ж виду, у зв'язку з чим він не є диференціюючою ознакою [15].

Найбільш інтенсивно пігменти утворюються на агарі з 10% знежиреного молока після 24-годинної інкубації при 37° С і на картоплі при температурі 20-25° С в аеробних умовах на світлі. S. aureus синтезує золотистий або оранжевий пігмент, зустрічаються і безпігментні штами. S. epidermidis, як правило, синтезує пігмент білого або жовтого кольору, у більшості штамів S. saprophyticus він відсутній. Пігменти стафілококів — каротиноїдні, не розчиняються у воді, але розчиняються в ефірі, бензині, ацетоні, етанолі. Крім типових S-форм, стафілококи можуть утворювати R-, G- і L-форми колоній. Зростання в рідкій культурі супроводжується рівномірним помутнінням, з часом випадає пухкий осад. При зростанні на звичайних середовищах стафілококи не утворюють капсули, однак при посіві уколом у напіврідкий агар з плазмою або сироваткою більшість штамів S. аureus утворює капсулу. Безкапсульні штами ростуть у вигляді компактних колоній, капсульні — утворюють дифузні колонії [19].

3. Біохімічна активність

Стафілококи мають  високу біохімічну активність: ферментують з виділенням кислоти (без газу) гліцерин, глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, маніт, утворюють різні ферменти (плазмокоагулази, фібринолізин, лецитиназу, лізоцим, лужну фосфотазу, ДНКазу, гіалуронідазу, телурітредуктазу, протеїназу, желатиназу тощо. Такі ферменти, як фібринолізин і гіалуронідаза, зумовлюють високу інвазивність стафілококу. Плазмокоагулаза є головним фактором їх патогенності: вона захищає від фагоцитозу і переводить протромбін у тромбін, який викликає згортання фібриногену, у результаті чого кожна клітина покривається білковою плівкою, що захищає її від фагоцитів. Зазначені ферменти відіграють важливу роль у метаболізмі стафілококів і багато в чому визначають їх патогенність. Енергетичний метаболізм у мікроорганізмів може бути двох типів: аеробне дихання і бродіння. Вуглеводи зброджують з утворенням органічних кислот (головним чином, молочної), ацетона і невеликої кількості СО₂. Діагностичне значення має здатність зброджувати глюкозу і маніт в анаеробних умовах. Цією здатністю володіють патогенні стафілококи [32].

За біохімічними властивостями поділяються на види:    1) S. аureus (має багато факторів патогенності, може мати різну локалізацію уражень);

2) S. epidermidis (вражає шкіру);      

3) S. saprophyticus (патоген сечостатевого тракту).                                              Для диференціації цих трьох видів використовують три тести:  

1) ферментацію  маніту в анаеробних умовах;    

2) продукцію  плазмокоагулази;      

3) чутливість  до антибіотика новобіоцину.            Для S. aureus всі три тести позитивні, для S. saprophyticus всі три тести негативні, S. epidermidis чутливий до новобіоцину [16] .

4. Антигенна структура стафілококів

У стафілококів виявлено більше 50 типів антигенів, до кожного з них в організмі  утворюються антитіла (загальні для всього роду Staphylococcus); які перехресно реагують з антигенами, спільними з ізоантигенами еритроцитів, шкіри і нирок людини (з ними пов'язані аутоімунні захворювання); видові і типоспецифічні антигени. За типоспецифічним антигеном стафілококи поділяють більш ніж на 30 сероваріантів. Однак серологічний метод типування стафілококів не отримав ще широкого застосування. Антигени стафілококів поділяють на: екстрацелюлярні (варіантспецифічні білки екзотоксинів та екзоферментів); целюлярні поверхневі (глікопротеїди) — варіантспецифічні; целюлярні глибокі (тейхоєві кислоти) — групоспецифічні.

До числа  видоспецифічних відносять білок А, який утворює S. аureus. Цей білок розташован поверхнево, він ковалентно зв'язаний з пептидогліканом, його мол. вага становить близько 42 кД. Білок А особливо активно синтезується в логарифмічній фазі росту при температурі 41⁰С, термолабілен, не руйнується трипсином; унікальною його властивістю є здатність зв'язуватися з Fc-фрагментом імуноглобулінів IgG (IgG1, IgG2, IgG4), у меншій мірі з IgМ і IgА. На поверхні білка А виявлено декілька ділянок, здатних з'єднуватися з ділянкою поліпептидного ланцюга імуноглобуліну, розташованим на кордоні доменів СН₂ і СН₃. Ця властивість знайшла широке застосування в реакції коаглютинації: стафілококи, навантажені специфічними антитілами, у яких залишаються вільними активні центри, при взаємодії з антигеном дають швидку реакцію аглютинації. Взаємодія білка А з імуноглобулінами призводить до порушень систем комплементу і фагоцитів в організмі хворого. Він має антигенні властивості, є сильним алергеном і індукує розмноження Т- і В-лімфоцитів. Його роль у патогенезі стафілококових захворювань з'ясовано ще не повністю. Штами S. аureus розрізняються за чутливістю до стафілококових фагів [22].

Для типування S. аureus використовують міжнародний набір з 23 помірних фагів, які розділені на 4 групи: 1 група — фаги 29, 52, 52А, 79, 80; 2 група — фаги 3А, 3С, 55, 71; 3 група — фаги 6, 42Е, 47, 53, 54,75, 77, 83А, 84, 85; 4 група — фаги 94, 95, 96; поза групами — фаг 81.

Чутливість до фагів є різною: один і той же штам може лізуватися або одним фагом, або одночасно кількома. Але оскільки чутливість їх до фагів є ознакою відносно стабільною, фаготипування стафілококів має важливе епідеміологічне значення. Недолік цього методу полягає в тому, що типуванню піддається не більше 65-70% S. аureus. В останні роки отримані набори специфічних фагів і для типування S. еpidermidis [27] .

1.5. Фактори патогенності

Стафілокок  — унікальний мікроорганізм. Може викликати більш ніж 100 різних захворювань, що відносяться до одинадцяти класів за Міжнародною класифікацією 1968р. Стафілококи можуть уражувати будь-яку тканину, будь-який орган. Ця властивість обумовлена наявністю у них великого комплексу факторів патогенності: фактори адгезії, ферменти, комплекс секреції екзотоксинів, мітогенна дія стафілококів відносно лімфоцитів, ентеротоксини А, В, С1, С2, С3, D, E [34] . 

Фактори адгезії — прикріплення стафілококів до клітин тканин (епітелію слизових оболонок, чи до інших чутливих клітин хазяїна) за допомогою спеціальних речовин-адгезинів, це зумовлено їх гідрофобністю (чим вона вище, тим сильніше виявляються адгезивні властивості), а також адгезивні властивості полісахаридів мікрокапсули і здатністю зв'язувати фібронектин (рецептор деяких клітин).      

Ферменти, які сприяють проникненню та поширенню стафілококів в організмі: плазмокоагулаза (головний фактор вірулентності), гіалуронідаза, фібринолізин, ДНКаза, лізоцимоподібний фермент, лецитиназа, фосфатаза, протеїназа і т. д.      

Комплекс секреції екзотоксинів: мембранопошкоджуючі токсини – α, β, δ, і γ. Раніше їх описували як гемолізини, некротоксини, лейкоцидіни, летальні токсини, тобто за характером їх дії: гемоліз еритроцитів, некроз при внутрішньошкірному введенні кролику, руйнування лейкоцитів, смерть кролика при внутрішньовенному введенні [28]. 

Однак виявилося, що такий ефект викликає один і  той же фактор — мембранопошкоджуючий токсин. Він має цитолітичну дію відносно різних типів, яка проявляється наступним чином. Молекули цього токсину спочатку зв'язуються з невідомими поки рецепторами мембрани клітини-мішені або неспецифічно абсорбуються ліпідами, що містяться в мембрані, а потім формують з 7 молекул грибоподібний гептамер, що складається з трьох доменів. Домени, що формують «капелюшок» і «край», розташовані на зовнішній поверхні мембран, а домен «ніжки» служить трансмембранним каналом-порою. Через неї і відбувається вхід і вихід невеликих молекул та іонів, що веде до набрякання та загибелі клітин, що мають ядро, і осмотичного лізису еритроцитів [15,16].                                                                        

Виявлено кілька типів мембранопошкоджуючих (пороутворюючих) токсинів: α, β, δ і γ-гемолізини (α, β, δ і γ — токсини). Вони розрізняються по ряду властивостей. Гемолізин α частіше виявляється у стафілококів, виділених від людини, він лізує еритроцити людини, кроликів і баранів. До його дії чутливі ендотеліоцити, поліморфноядерні лейкоцити, фібробласти, гепатоцити, тромбоцити та ін. У результаті лізису вивільняються цитокіни і медіатори запалення, активуються ендонуклеази, підвищується екзоцитоз тромбоцитів. Усе це зумовлює розвиток патологічних наслідків. При введенні лабораторним тваринам α-токсина утворюються шкірні некротичні реакції, після внутрішньовенного введення — загибель тварин. Летальний ефект у кроликів виникає при внутрішньовенному введенні через 3-5 хв.        

Гемолізин β виявляють частіше у стафілококів тваринного походження, він викликає лізис людських і баранячих еритроцитів (краще при більш низькій температурі).  Гемолізин δ лізує еритроцити людини і багатьох видів тварин. Летальну дію на кролика при внутрішньовенному введенні викликає через 16-24-48 г. Дуже часто у стафілококів виявляються α- і β-токсини одночасно; ексфоліативні токсини А і В розрізняють за антигенними властивостями по відношенню до температури (А-термостабільний, В-термолабільний), локалізації генів, що контролюють їх синтез (А контролюється хромосомним геном, В-плазмідним). Нерідко в одного і того ж штаму S. aureus синтезуються обидва ексфоліатіна. З цими токсинами пов'язана здатність стафілококів викликати пухирчатку у новонароджених, бульозні імпетиго, скарлатиноподібний висип; істинний лейкоцидін — токсин, що відрізняється від гемолізинів за антигенними властивостями, вибірково діє на лейкоцити, руйнуючи їх; екзотоксин, що викликає синдром токсичного шоку [33].

Фактори, які  пригнічують фагоцитоз. Наявність  їх може проявлятися у пригніченні  хемотаксису, захисту клітин від  поглинання фагоцитами, в забезпеченні стафілококами можливості розмножуватися в фагоцитах і блокуванні «окисного вибуху». Фагоцитоз пригнічують капсула, білок А, пептидоглікани, тейхоєві кислоти, токсини. Крім того, стафілококи індукують синтез деякими клітинами організму (наприклад спленоцитами) супресорів фагоцитарної активності. Пригнічення фагоцитозу не тільки перешкоджає очищенню організму від стафілококів, але і порушує функцію процесингу та представлення антигенів Т- і В-лімфоцитами, що веде до зниження сили імунної відповіді. Наявність капсули у стафілококів підвищує їх вірулентність для білих мишей, робить стійкими до дії фагів, не дозволяє типувати аглютинуючими сироватками і маскує білок А. Тейхоєві кислоти не тільки захищають стафілококи від фагоцитозу, але й грають істотну роль у патогенезі стафілококових інфекцій [2].

Встановлено, що у дітей які страждають на ендокардит, в 100% випадків виявляються антитіла до тейхоєвих кислот.

Мітогенна дія стафілококів відносно лімфоцитів. ЇЇ мають білок А, ентеротоксини та інші продукти, що секретуються стафілококами.

Ентеротоксини А, В, С1, С2, С3, D, E. Вони  характеризуються антигенною специфічністю, термостабільністю, стійкістю до дії формаліну (не перетворюються на анатоксини) і травних ферментів (трипсину і пепсину), стійкі в діапазоні рН від 4,5 до 10,0. Ентеротоксини є низькомолекулярними білками з мол. вагою від 26 до 34 кД з властивостями суперантигенів. В останні роки все більшу увагу привертають антигени, в основному мікробного походженн, здатні до поліклональної активації клітин імунної системи, через що вони отримали назву суперантигенів. Такі антигени виявлені у стафілококів, стрептококів, мікоплазм, деяких вірусів [3].

Суперантигени завдяки своїй хімічній природі  можуть зв’язуватись з клітинними антигенрозпізнавальними рецепторами Т-лімфоцитів (ТКР, або TCR) та з деякими ділянками імуноглобулінів. Але на відміну від звичайних антигенів, суперантигени сполучаються з ТКР і Іg не в місцях активних центрів, а в інших ділянках молекул. Тому суперантигени здатні зв’язувати різні Т-лімфоцити та імуноглобуліни незалежно від їх специфічності. Крім того, суперантигени не потребують процесингу антигенпрезентуючими клітинами, а можуть одразу зв’язуватись з молекулами МНС на їх поверхні, не входячи у щілину активного центру МНС. Через перелічені вище особливості суперантигенів може відбуватися так звана поліклональна активація Т-клітин і неспецифічна поліклональна блокада антитіл. У результаті активовані Т-лімфоцити продукують цитокіни (медіатори імунної відповіді), що спричиняє синдром загальної інтоксикації. При цьому специфічна імунна відповідь на певні антигени пригнічується , і навіть спостерігається загибель (апоптоз) Т-лімфоцитів, що проявляється симптомами імунодефіциту.

Встановлено, що суперантигени  індукують апоптоз (запрограмовану загибель) більшості неспецифічно активованих Т-лімфоцитів і дендритних клітин. Це пояснює тривалу імунодепресію після інфекції, збудники якої несуть суперантигени.

Встановлено також, що існують  генетично обумовлені відмінності  в чутливості до стафілококової інфекції та характеру її перебігу у людей. Зокрема, важкі стафілококові гнійно-септичні захворювання частіше виявляються у людей з групами крові А і АВ, рідше — у осіб 0 [20].

2. ЧУТЛИВІСТЬ СТАФІЛОКОКІВ ДО АНТИБІОТИКІВ