Изменение фосфолипидного состава мембран

 

 

Рисунок 1.2 - Макроаутофагия, микроаутофагия  и шаперон-зависимая аутофагия

 

Ороговение. Ороговение или кератинизация, - это специфическая форма программируемой гибели клеток, которая имеет место в эпидермисе и морфологически и химически отличается от апоптоза. Ороговение приводит к образованию рогового слоя, состоящего из корнеоцитов – погибших кератиноцитов, содержащих специфические белки (кератины, лорикцин, инволюкрин и др.). Такая организация необходима для функционирования кожи: она обеспечивает такие ее свойства, как механическое сопротивление, эластичность, гидрофобность, структурная стабильность и др. Ороговение часто рассматривается как реализация программы терминальной дифференцировки, аналогичной той, которая существует в некоторых других тканях (хрусталиковые волокна, зрелые красные кровяные клетки).

На молекулярном уровне ороговение происходит в результате функционирования специфического механизма дифференцировки  эпителиальных клеток, в ходе которой кератиноциты экспрессируют все ферменты и субстраты, необходимые для построения эпидермального барьера, позволяющего изолировать организм от окружающей среды. Эффект достигается: 1) путем перекрестного связывания трансглутаминазами 1, 3 и 5-го типов нескольких субстратов, таких, как лорикрин, кератин, инволюкрин; 2) путем синтеза специфических липидов, высвобождающихся во внеклеточное пространство, где они ковалентно связываются с белками ороговевшей оболочки и ограничивают проницаемость барьера; 3) путем синтеза протеаз, необходимых для дескваминации роговых пластов. Морфологическими признаками ороговения могут служить: элиминация органелл, накопление лорикнина и филаггрина соответственно в L- и F- кератогиалиновых гранулах, высвобождение липидов из ламеллярных телец во внеклеточное пространство и десквамация корнеоцитов путем активации протеаз (рисунок 1.1,г). Биохимическими критериями ороговения принято считать усиление экспрессии трансглутаминаз и их субстратов, а также усиление перекрестного связывания вышеуказанных белков [12].

 

1.1.1 Молекулярные механизмы путей и гены программируемой

    клеточной   гибели

 

В развитии программируемой клеточной гибели условно различают 3 фазы. Начальная фаза или фаза индукции, связана с ранними событиями, развивающимися без существенных изменений метаболизма и морфологии клетки, в результате которых принимается решение о самоуничтожении. Эта стадия лучше всего изучена на примере апоптоза, запускаемого лигандами, структура которых наиболее полно изучена на примере Fas-рецептора и рецептора фактора некроза опухали.  В ответ на связывание с лигандом Fas-рецепторы образуют внутриклеточный кластер, состоящий из доменов «смерти». Эти домены в свою очередь взаимодействуют с белком, который затем регулирует активность специфического фермента (прокаспаза-8). В результате такой регуляции прокаспаза-8 претерпевает аутогидролиз с образованием активного фермента каспазы-8. установлено, что эффекторная каспаза-8 может активировать и другие каспазы (каспазу-3 и 7). Рассмотренные выше события составляют основу второй, или исполнительной фазы, после чего процесс становиться необратимым и клетка входит в 3 фазу – фазу самодеградации. Приводящая  к гидролизу структурных белков клетки. Кульминацией можно считать активизацию  нуклеаз, когда начинается фрагментация геномной ДНК, что является биохимическим маркером апоптоза [13]. Это явление необратимо, оно продолжается до наступления изменений в клеточной проницаемости, что и приводит клетку к гибели. В большинстве клеток такую фрагментацию ДНК вызывают кальций и магний-зависимые ядерные эндонуклеазы, которые избирательно «разрезают» ДНК на отрезки, локализованные между нуклеосомами (линкерные участки ДНК), и приводят к образованию моно- и олигонуклеосомных фрагментов ДНК. Процесс активации ферментов тонко регулируется и является АТФ-зависимым. Нуклеазной атаке подвергаются не только эухроматиновые (генетически активные), но и спирализованные уплотненные гетерохроматиновые участки. Для того, чтобы запустить этот процесс, клетка должна произвести ферменты – нуклеазы, что приводит к усилению процессов транскрипции (биосинтез РНК) и трансляции (биосинтез белка). Имеются данные, что ингибиторы белкового синтеза - циклогексамид и пуромицин - предотвращают энзиматический распад хроматина и могут предотвратить или отсрочить процесс апоптоза. Хлористый цинк также приводит к предотвращению фрагментации ДНК и отсрочивает апоптоз. Программируемая клеточная смерть может иногда приостанавливаться при ингибировании транскрипции или трансляции нуклеиновых кислот [14]. Это свидетельствует о том, что гибель клетки регулируется  клеточными механизмами.

 

Рисунок 1.3 - Этапы апоптоза трофобластической клетки: 1А - клетка сморщивается, теряя в течение нескольких минут до 1/3 своего объема; 1В - гетеро- и эухроматин, становится суперконденсированным, принимает форму полумесяца (подковы) по периферии ядра; 1С – продолжение сокращения клетки; 1D - появления специфических мембранных выпячиваний; стрелкой обозначено апоптотическое тельце

 

Отличительным морфологическим  проявлением апоптоза является коллапс ядра. После получения сигнала, призывающего клетку подвергнуться апоптозу, в ней происходит целый ряд биохимических и морфологических изменений. В отличие от некроза, при апоптозе клетка сморщивается, теряя в течение нескольких минут до 1/3 своего объема           ( рисунок 1.3, А). “Усыхание” хорошо выражено как в культуре клеток, так и в тканевых срезах, где апоптотическая клетка отделяется от соседних клеток. Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным, принимает форму полумесяца (подковы) по периферии ядра (рисунок 1.3, В).

Клетки продолжают сокращаться (рисунок 1.3, C), принимая форму, удобную для фагоцитирования их макрофагами (или соседними клетками). Последние, в свою очередь, ответственны за удаление апоптотических клеток из тканей крайне «деликатным» способом. Изменения на уровне мембран клеток могут наблюдаться  морфологически в виде появления специфических мембранных выпячиваний (рисунок 1.3, D) или пузырей, которые часто завершают апоптотический процесс. Небольшие пузырьки часто называют «апоптозными тельцами» [15].  Далее еще живые апоптозные тельца утилизируются, содержимое клетки не попадает во внеклеточную среду и не вызывает воспалительных явлений. Таким образом, уничтожение клеток путем апоптоза обеспечивает минимальное повреждение тканей и является более «деликатным» по сравнению с некротическим механизмом гибели.        

Исследования продемонстрировали, что процесс апоптоза генетически детерминирован и регулируется следующими генами: усиление работы генов Cip1 (p21), Bax (p21), Daax, FAF-1, FADD, TRADD, RAIDD, RIP, SIVA, FLIP, CAS, TIA-1/TIAR, TDAG51 и др., белков p53, р21 ускоряет течение апоптоза, гены семейства Bcl-2, Bad, Bag1 препятствуют апоптозу [16].     Важен и тот факт, что после начального повреждения нередко включается некий триггерный механизм. Он приводит к тому, что каскадная гибель клеток может продолжаться даже после удаления первичного стимула нейронного апоптоза. Мнения исследователей по вопросу о факторах, индуцирующих апоптоз, представлены в литературе достаточно широко. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, гамма -, рентген- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др. Во всех этих случаях происходит индукция  апоптоза, но при увеличении дозы соответствующего агента может развиться некроз. «Неспецифичность» этих воздействий заключается в том, что они не имеют адресной мишени в клетке и индуцируют множественные поражения генома, белков или (и) вызывают биоэнергетическую катастрофу.  Поскольку апоптоз - физиологическое явление, то в организме имеются и специфические факторы, приводящие к апоптозу клетки. К настоящему времени известно, что апоптоз могут вызывать как внутриклеточные сигналы, так и внешние, сами по себе не являющиеся токсическими или деструктивными, и опосредующие свое действие через рецепторные системы. В целом, если идет речь о физиологических факторах, то, вероятно, следует применять термин регуляция апоптоза клетки, поскольку известна группа физиологических активаторов и ингибиторов апоптоза. Снижение производства энергии вызывает повышение активности кислорода и может стать пусковым механизмом развития апоптоза как в здоровых, так и в больных клетках [17].  Среди растущего числа выявленных пусковых механизмов апоптоза выделяются некоторые факторы, играющие в этом процессе ведущую роль. Выделены аминокислоты, избыток которых патологически повышает деполяризацию клеточной мембраны. Кроме того, в больших количествах они являются токсинами, что дает возможность признать их роль в происхождении многих неврологических нарушений. Повышение концентрации этих аминокислот приводит к накоплению калия, кальция и освобождению свободных радикалов внутри клеток. К физиологическим факторам, способным запускать в клетках апоптотическую программу, относится также оксид азота (NO) - одна из ключевых сигнальных молекул, регулирующих функции сердечно- сосудистой, нервной и иммунной систем организма. Оксид азота участвует в нейротрансмиссии в центральной и периферической нервных системах [18]. S. Snyder, директор института нейробиологии J. Hopkins Medical School отметил: «За мои 25 лет работы в нейробиологии я не знал другую молекулу, которая так активно влияла бы на физиологические и патологические функции организма».   В силу своих небольших размеров NO- молекула липофильна, способна проникать через мембраны клетки и реагировать с множеством биохимических мишеней, в том числе с гемогруппами, железными и цинковыми кластерами. Нарушение синтеза или регуляции количества NO способно воздействовать на множество важных биологических процессов и приводить к различным заболеваниям [19]. Доказана роль оксида азота в регулировании нейроапоптоза. При этом в зависимости от концентрации NO и типа клетки, оксид азота может как стимулировать апоптоз, так защищать клетку от смерти [20].  Выявлено, что окись азота способна также ингибировать апоптоз различных типов клеток: лейкоцитов, гепатоцитов,  эндотелиальных клеток. В больших концентрациях NO - мощный нейротоксин. Среди прочих факторов индукции апоптоза следует отметить увеличение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и свободных радикалов - активных форм кислорода (АФК). Митохондрии играют важную роль  в ПОЛ, как поставщик ряда апоптогенных факторов, в частности свободные радикалы (ОН^-) [21].

 

1.2 Окислительный стресс

 

Окислительный стресс - один из наиболее значимых механизмов повреждения клетки, запускающий патологические реакции, которые необратимо повреждают клетку и приводят к запуску генетически запрограммированной гибели.  

Следует отметить, что существование  человека в условиях современной  техногенной цивилизации неизбежно  приводят к постоянному появлению  стрессовых ситуаций, их накоплению и в конечном счете к развитию патологических изменений в различных органах и системах. Негативное влияние факторов окружающей среды (табачный дым, загрязнение воздуха выбросами транспорта и промышленных предприятий, радиационное и ультрафиолетовое излучение, ксенобиотики, в том числе лекарства, анестетики, пестициды, промышленные растворители и др.), чрезмерная физическая нагрузка, стресс, переутомление сопровождаются увеличением образования свободных радикалов.

Нарушение обмена веществ  и энергии, накопление активных повреждающих агентов (свободных радикалов, прооксидантов, АФК), инициирующих повреждение клеток и ведущих к развитию различных патологических состояний, получило название оксидативного стресса.  Его основу составляет свободнорадикальное окисление жирных кислот, или так называемое перекисное окисление липидов (ПОЛ) [22].  

Окислительный стресс может  быть следствием различных механизмов:

1) повышенного образования реактивных оксидантов, образующихся при окислении как самих углеводов, так и углеводов, образующих комплексы с различными белками, а также в результате аутоокисления жирных кислот в триглицеридах, фосфолипидах и эфирах холестерина;

2) снижения активности антиоксидантной системы в организме, которая представлена глютатионом, глютатионпероксидазой, каталазой, супероксиддисмутазой, витаминами К, Е, С, α-липоевой кислотой и другими антиоксидантами (таурин, каротин, мочевая кислота и коэнзим Q10);

3) нарушения ферментов полиолового обмена глюкозы, митохондриального окисления, обмена простагландинов и лейкотриенов и снижения активности глиоксалазы [23].

 

1.3 Антиоксидантная система

 

В противовес свободнорадикальным процессам в организме существует антиоксидантная система (АОС), представляющая собой совокупность защитных механизмов клеток, тканей, органов и систем, направленных на сохранение и поддержание гомеостаза в организме.

Равновесие между этими  двумя противоположными составляющими  в состоянии физиологического оптимума удерживает перекисное окисление на определенном низком уровне, препятствуя развитию цепного окислительного процесса и характеризует антиоксидантный статус организма. Без его универсальной эндогенной системы защиты нормальное существование организмов в биосфере Земли в условиях загрязненной атмосферы, естественного радиационного фона и ультрафиолетового излучения Солнца было бы невозможным [24].

Различают ферментативные и  неферментативные составляющие АОС. Ферментативное звено представлено глутатионпероксидазой, супероксиддисмутазой и каталазой. Они имеют определенную специализацию по отношению к конкретным видам радикалов и перекисей. Согласно имеющимся данным, активность глутатионпероксидазы уже на ранних стадиях сосудистой патологии головного мозга уменьшена почти вдвое по сравнению со здоровыми и имеет тенденцию к дальнейшему уменьшению по мере прогрессирования заболевания.

Неферментативное звено АОС состоит из соединений в которые входят витамины, так и флавоноиды [25].

 

1.3.1  Роль флованоидов как антиоксидантов

 

Флавоноиды вместе с другими полифенолами потенциально полезны для здоровья человека благодаря их антиоксидантным, антибактериальным, антивирусным, противовоспалительным и антиаллергическим свойствам.

Овощи, фрукты и зеленый  чай - богатые источники полифенолов.

Все флавоноиды в той или иной степени обладают антиоксидантными свойствами. Флавоноиды широко распространены в растительном мире. Особенно богаты флавоноидами высшие растения. Находятся флавоноиды в различных органах, но чаще в надземных: цветках, листьях, плодах. Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5%, иногда достигает 20% (в цветках софоры японской). Флавоноиды для человека полезны прежде всего тем, что они участвуют в окислительно-восстановительных реакциях организма, способствуя выработке оксида азота [26].

Вплоть до недавнего времени  роль оксида азота для организма  была изучена плохо. Однако, в 1998 году Луи Игнаро,Ферид Мьюред и Роберт Фёрчготт были награждены Нобелевской премией по физиологии и медицине за установление функциональной роли этого соединения в работе сердечно-сосудистой системы. Итак, в результате исследований было выявлено, что оксид азота:

- способствует регуляции  кровяного давления, что доказали  и голландские ученые, изучая  свойства шоколада;

- предотвращает окисление  холестерина - причину образования  тромбов, за что флавоноиды получили звание эффективных антиоксидантов;

- положительно воздействует  на нервную систему и бронхи;

- укрепляет иммунитет.

Во многих фруктах и  ягодах биофлавоноиды более или менее равномерно распределены в кожице и мякоти. Поэтому слива, вишня, смородина, облепиха, черника и др. имеют ровную окраску. В противоположность этому, в плодах некоторых других растений флавоноиды содержатся, в основном, в кожице, и, в меньшей степени, - в мякоти. А в яблоках, например, они имеются только в кожице[22].  

Биологическая роль флавоноидов  заключается в их участии в  окислительно-восстановительных процессах, происходящих в растениях. Они выполняют  защитные функции, предохраняя растения от различных неблагоприятных воздействий  окружающей среды.  

Многие флавоноиды обладают Р-витаминной активностью, уменьшают хрупкость кровеносных капилляров, усиливают действие аскорбиновой кислоты, оказывают седативное действие. Используются как противовоспалительное, противоязвенное средство. Некоторые - обладают кровоостанавливающими свойствами; применяются при геморрое; служат хорошими желчегонными средствами. В последние годы появились сообщения о противоопухолевом действии флавоноидов. Однако препаратов, содержащих чистые флавоноиды, пока имеется немного[23]. Чаще эти соединения находятся в растениях в комплексе с другими биологически активными веществами и используются суммарно. Лекарственными формами, содержащими флавоноиды, могут быть высушенные растительные ткани, экстракты из растительного сырья или флавоноидные комплексы, выделенные в чистом виде [27].

      Антиоксидантная активность фенольных соединений объясняется двумя их особенностями. Во-первых, они связывают ионы тяжелых металлов (образуя с ними  довольно прочные, яркоокрашенные и стабильные комплексы), которые являются катализаторами окислительных процессов. Так, например, соли свинца с флавоноидами образуют желтые или оранжевые комплексы. Ионы металлов  катализируют свободное окисление органических соединений при доступе молекулярного кислорода. Флавоноиды, соединяя комплексообразующую способность с относительной безвредностью и малой токсичностью, тем самым ослабляют или выключают каталитическое действие свободных ионов тяжелых металлов.

      Во-вторых,  флавоноиды могут служить ловушкой для свободных радикалов, благодаря наличию активных гидроксильных групп, способных к комплексообразованию. От количества гидроксильных групп зависят индивидуальные антиоксидантные свойства - чем их больше, тем мощнее антиоксидант.  Способность к обратимому окислению, свойственна далеко не всем флавоноидам. При расположении гидроксильных групп рядом (орто-положении) и напротив (пара-положении) легко образуются хиноны.  А флавоноиды с наличием гидроксильных групп в мета-положении практически не окисляются, потому что при таком расположении гидроксилов невозможна перестройка электронной структуры.

      Таким образом, флавоноиды играют роль антиоксидантов - веществ, которые предупреждают неферментное перекисное окисление органических соединений. Одними из самых сильных антиоксидантов являются: кверцетин, пикногенол, рутин и гесперидин [28].