Курсовая по микробиологии

     1.2 Методы контроля  микробиологического  состава почв

     Численность и биомасса микроорганизмов в почве [6]

     Метод стекол обрастания Холодного

     Метод Холодного и его модификации широко применяются в почвенной микробиологии. Чистые предметные стекла закладывают в почву вертикально и оставляют на месяц и более. Затем их осторожно извлекают из почвы и готовят к микроскопическому исследованию. Изучение пейзажей на стеклах обрастания можно проводить после окраски эритрозином с помощью светооптнческого микроскопа, пользуясь иммерсионной системой. Хорошие результаты дает люминесцентная микроскопия.

     Слегка  подсохшие на воздухе стекла с  микробными ассоциациями помещают вертикально  в пеналы с прорезями. Для фиксации препаратов под крышку пенала помещают небольшой комочек ваты, смоченный  формалином. В таких пеналах стекла обрастания могут храниться длительное время.

     Перед изучением полученных препаратов под  микроскопом их следует окрасить. Предварительно перед окраской влажным  ватным тампоном со стекол снимают  обрастания, прикрепившиеся к их нижней поверхности! Обрастания, находящиеся  на верхней (маркированной) поверхности, прикрепляются к стеклам так  же, как обычные бактериологические мазки. Для этого стекла 3-4 раза нижней стороной проводят над пламенем горелки. Окрашивают стекла карболовым эритрозином. фуксином или метиленовым синим, При использовании 5%-ного карболового эритрозина продолжительность окраски 30-40 мин. Применение более слабых красителей увеличивает время окраски от нескольких часов до одних суток. Отмывают стекла проведением их через ряд сосудов с дистиллированной водой. Следует рационально применять и методы дифференциальной окраски. Так, для обнаружения железобактерий перед окраской эритрозином стекла помещают на 2-3 мин в 5%-ный раствор желтой кровяной соли, а затем на 1-2 мин в 5%-ный раствор соляной кислоты. При такой комбинированной окраске железобактерии окрашиваются в красный цвет, а их железистые футляры – в синий.

     Пользуясь методом дифференциальной окраски но Пешкову и методом люминесцентной микроскопии, в микробных ценозах можно выявить живые и мертвые клетки, т.е. определить состояние микроорганизмов в сообществах. Для окраски по способу Пешкова необходимо иметь следующие реактивы: фиксатор, состоящий из 60 мл этилового спирта (96-градусного), 30 мл ледяной уксусной  кислоты и 10 мл хлороформа; краску Гимза: азур II (разведение 1:1000), эозин (разведение 1:1000); водный раствор краски лихтгрюн (0,25%-ный).

     При окраске пластинку обрастания следует 20 мин обработать фиксатором, просушить  на воздухе 1 ч и на 4 ч погрузить  в краску Гимза при 37 °С или выдержать в той же краске при комнатной температуре в течение суток. После этого стекла обрастания следует промыть нейтральной дистиллированной водой (рН 7,1) и 20 ч докрашивать лихтгрюном. После окраски стекла промывают водой, подсушивают и микроскопируют. При таком способе окраски микроорганизмы, бывшие живыми до фиксации, окрашиваются в фиолетовый цвет, а отмершие еще до фиксации – в зеленый.

     Выявление в микробных ценозах живых и мертвых клеток можно осуществить с помощью люминесцентной микроскопии. Для одновременного обнаружения тех и других клеток при флюорохромировании используют смесь растворов примулина (1:40000) и акридинового оранжевого (1:100000) в соотношении 1:2. Живые клетки микроорганизмов при этом светятся зеленым, а мертвые – желтым пятном.

     Для выявления мертвых бактерий наилучшими флюорохромами являются примулии, тиазоловый желтый и бриллиант-дианилоиый зеленый. При флюорохромировании этими красителями в разведении 1:100000 мертвые клетки ярко люминесцируют, а живые почти не светятся.

     Изучают стекла обрастания под микроскопом. Для обнаружения характерных  особенностей микробных ценозов препараты просматривают вначале при малом увеличении, а затем детально, переходя от одного поля зрения к другому, – под иммерсией. После тщательного изучения и описания микробных пейзажей наиболее характерные фрагменты фотографируют. Хорошие результаты получаются при использовании фотопленки «Микрат» или репродукционных штриховых пластинок.

     Метод капиллярной педоскопии. Наиболее четкое представление о развитии микроорганизмов непосредственно в почве дает метод капиллярной педоскопии, разработанный Б. В. Перфильевым и Д. Р. Габе. Для изучения микробных пейзажей ими был сконструирован прибор, имитирующий капиллярные каналы почвы, – капиллярный педоскоп. Он состоит из набора пятиходовых капиллярных ячеек с тонкой кровлей, вставленных в стеклянную обойму или держатель. Для установки педоскопа в почву пользуются пробойником, состоящим из стальной пластинки с заостренным концом, деревянной ручки и футляра. Перед закладкой педоскопа в почву погружают сначала пробойник, затем, придерживая футляр пинцетом, пластинку пробойника вынимают из футляра и в освободившуюся щель вводят педоскоп, ориентируя его таким образам, чтобы капиллярные каналы были направлены вертикально или наклонно. Для микроскопировапия педоскопические ячейки, вынутые из держателя и окрашенные, укрепляют канадским бальзамом на тонкой стеклянной пластине (от 0,2 до 0,3 мм толщиной), заменяющей предметное стекло.

     Прямые  микроскопические методы учета микроорганизмов в почве [6]

     Метод Виноградского  основан на подсчете клеток микроорганизмов в проходящем свете. Почвенную суспензию в разведении 1:10 диспергируют каким-либо из известных способов (растиранием почвы в ступке резиновым пестиком, обработкой с помощью пропеллерной мешалки, действием ультразвука, применением химических средств диспергирования и др.). Наилучшие результаты дает обработка почвенной суспензии ультразвуком низкой частоты и мощности. Оптимальный режим обработки на установке УЗДН-1 таков: время 30 с, сила тока 0,40 А, частота 15 кГц.

     При работе с богатыми органическим веществом  почвами из полученной суспензии готовят разведение 1:100. После энергичного встряхивания и отстаивания в течение нескольких секунд (для осаждения наиболее крупных почвенных частиц) стерильной микропипеткой наносят 0,01 мл суспензии на чистое обезжиренное предметное стекло ч равномерно распределяют на прямоугольнике площадью 8 см². Из одной пробирки готовят не менее трех препаратов. Препарат подсушивают, фиксируют над пламенем газовой горелки и помещают в стаканчики с карболовым эритрозином. Стекла выдерживают в эритрозине от 1 ч до 1 сут. Окрашенные препараты осторожно промывают в воде, высушивают и просматривают под иммерсией в световом микроскопе.

     При равномерном распределении микроорганизмов  на площади мазка достаточно на каждом препарате подсчитать 20 полей зрения.

     Люминесцентная  микроскопия.

     Люминисцентный метод по Д.Г. Звягинцеву и П.А. Кожевину

     Метод состоит в подсчете клеток препарата, окрашенного флюорохромом, в ультрафиолетовом свете.

     Диспергированную почвенную суспензию, разведенную в 10 раз, переносят в мерный цилиндр на 100 мл. После 2-мннутного отстаивания пипеткой отбирают 2 мл суспензии из средней фракции и переносят в колбу с 18 мл воды. Колбу энергично встряхивают и наносят микропипеткой 0,01 мл на обезжиренное предметное стекло, распределяя равномерно на площади 4 см² (2x2 см).

     Удобно  для распределения мазков подкладывать под стеклышко трафарет, начерченный  на бумаге. Препараты подсушивают  и фиксируют над пламенем горелки, а затем окрашивают 2-4 мин водным раствором акридинового оранжевого (разведение 1:10000). Для промывки препараты погружают на 10 мин в водопроводную воду. Окрашенные препараты высушивают при комнатной температуре.

     Для микроскопирования на препарат наносят каплю воды и покрывают обезжиренным покровным стеклом. Лишнюю воду удаляют фильтровальной бумагой. Препараты просматривают на люминесцентном микроскопе. Микробные клетки имеют ярко-зеленое свечение, почвенные частицы – красное.

     Число микробных клеток в 1 г почвы вычисляют по формуле: 

                                                                          ×                                                          (1) 

     где а – среднее число клеток в поле зрения; Р – площадь поля зрения, мкм²; п – показатель разведения; желательно подобрать разведение таким образом, чтобы среднее число клеток в поле зрения составляло 5-10.

     Для подсчета рекомендуется из каждого  почвенного образца готовить два препарата и на каждом из них подсчитать по пять полей зрения. При постановке продолжительных опытов нужно иметь в виду, что по мере эксплуатации источников света снижается яркость свечения клеток, что может привести к занижению результатов. Поэтому желательно периодически проводить контрольный подсчет па другом микроскопе и использовать другие способы контроля. Исходный 0,1%-ный раствор флюорохрома рекомендуется готовить сразу в количестве, достаточном для проведения всей серии опытов, и хранить при 4°С в закрытой посуде из темного стекла. Рабочие растворы (1:1000) не хранят.

     Люминесцентный  метод обеспечивает более точный подсчет микроорганизмов по сравнению  с методом Виноградского, а также  позволяет учитывать и адсорбированные клетки, невидимые в проходящем свете.

     Электронная микроскопия

     Электронно-микроскопический метод

     Учет  микроорганизмов с помощью электронного микроскопа имеет преимущество перед описанными методами – он позволяет обнаруживать мельчайшие микроорганизмы, размеры которых выходят за пределы разрешающей способности оптического микроскопа.

     После предварительной обработки почвенную  суспензию переносят в стерильный мешочек из синтетического полупроницаемого материала и подвергают диализу в стерильной дистиллированной воде в течение 3-12 ч. Мешочки для диализа, прикрепленные к стеклянному кольцу, закрывают ватной пробкой, а стакан – ватой, смоченной толуолом. После диализа суспензию хорошо перемешивают и наносят на пленки-подложки для электронного микроскопа. Следует учитывать, что мутность суспензии должна быть примерно в 10 раз больше применяемой при работе со световым микроскопом. Каплю наносят микропипеткой объемом 0,1 мл с оттянутым до капилляра концом. Конец пипетки перед отбором суспензии покрывают тонким слоем стерильного вазелина, используя для этого простерилизованные полоски фильтровальной бумаги. Слой вазелина препятствует затеканию взвеси на нижнюю часть пипетки и образованию капель избыточного объема.

     Для изготовления препаратов, предназначенных  для количественного учета, отбирают (при просмотре в бинокулярном микроскопе) сетки с одинаковыми диаметрами полей зрения (3000-3400 мкм) и квадратными отверстиями со стороной квадрата 30 мкм. На одну сетку наносят каплю и фиксируют ее точный объем. При нанесении капли пипетку следует держать под углом 30-40° к плоскости сетки. Расстояние кончика капилляра от пленки 5-8 мм. Капля должна падать на сетку, не выходя за ее края. После высыхания капель препараты оттеняют хромом или окисью вольфрама и просматривают в электронном микроскопе, ´8000. Сетки одной партии с коллодиевыми пленками перед нанесением капель удобно располагать рядами на донышке чашки Петри, к которой снизу прикреплен лист бумаги с пронумерованными квадратами. Для каждого варианта опыта подготавливают 10-20 сеток. Во всех пригодных для учета сетках (10-15 штук) производят подсчет микробных клеток в возможно большем числе полей зрения. Просмотр препарата на сетке и учет клеток в пределах каждого поля зрения целесообразно проводить в определенном порядке. Например, поля и объекты в каждом поле следует просматривать, начиная слева по часовой стрелке (точнее, по спирали) до центра сетки. Число микробных клеток без особых затруднений удается учитывать в среднем в 10-30 полях зрения (из 100) на каждой сетке.

     Расчет  производят по формуле: 

                                                                   p                                                                          (2) 

     где М – число клеток микроорганизмов в 1 мл суспензии; n – число микроорганизмов в просчитанном квадратике (среднее арифметическое); R – радиус сетки, мкм; а – сторона квадрата ноля зрения, мкм; V – объем капли, мл; р – разведение суспензии. Затем рассчитывают число клеток, приходящееся на 1 г почвы, на 1 га и т. д.

     С помощью описанного метода удается  подсчитать наибольшее по сравнению  с другими методами число микроорганизмов. 

     1.2.1 Методы определения  содержания грибов

     Грибы – низшие эукариотические одноклеточные и мицелиальные хемоорганотрофные организмы. Их относят к особому царству живых существ – Mycota. Представителей грибов делят на макро- и микромицеты. Макромицеты образуют крупные плодовые тела, отсутствующие у микромицетов. У последних на протяжении всего жизненного цикла имеются только микроскопические структуры [5].