Курсовая по микробиологии

     где К – количество СО₂, мг; а и b – количество 0,1 н. H₂SО₄ (мл), пошедшее на титрование в холостом и рабочем определениях; 4,4 – коэффициент, характеризующий количество СО₂, эквивалентное 1 мл 0,1 н.

     Измерения проводят при 24-часовых экспозициях  или кратных 24 ч, чтобы при измерении  в поле рассчитать суммарное выделение  СО₂ без учета влияния колебаний в течение суток. Скорость выделения СО₂ определяют, как правило, в течение нескольких последовательных экспозиций непрерывно.

     Метод Л.Р. Карпачевского

     Определяется  интенсивность дыхания почвы без камер-изоляторов. Для этого в стеклянные стаканы на 50-100 мл диаметром 4-6 см наливают 2 мл 0,1 н. КОН, разносят их на изучаемом участке и ставят на почву. Время экспозиции 20 мин. Затем щелочь оттитровывают 0,1-0,05 н. серной кислотой в присутствии фенолфталеина. Проводят также контрольное титрование 2 мл 0,1 н. щелочи. Выделившуюся углекислоту определяют по формуле: 

                                                             ×                                                          (12) 

     где С – количество СО₂, кг/(га×ч); а – количество H₂SО₄, пошедшее на титрование поглотителя в контроле; b – количество H₂SO₄, затраченное на титрование поглотителя в опыте; п – нормальность H₂SО₄; S – площадь поглотителя.

     Следует отметить, однако, что методика Л. О. Карпачевского предусматривает фактически определение концентрации СO₂ в приземном слое воздуха и не всегда соответствует активности выделения СO₂ почвой. 

     1.4 Биокалориметрический анализ биологической активности и содержания микроорганизмов в почве [10] 

     Микробиокалориметрия относится к теплометрическим методам анализа. Колориметрия как инструментальный физико-химический метод анализа широко используется в аналитике для изучения различных физических, химических и биологических процессов, сопровождающихся обменом тепла с окружающей средой.

     Биокалориметрия как область калориметрии изучает энергетические процессы, протекающие в макро- и микроорганизмах. Обмен энергии с окружающей средой является универсальным свойством всех живых организмов, поэтому биокалориметрия рассматривается как универсальный метод исследования их жизнедеятельности. Поскольку теплопродукция живых организмов широко варьирует в зависимости от их размеров и активности, в биокалориметрии выделена область низкоинтенсивных тепловых потоков 10⁰-10³ мкВт, анализом которой занимается микробиокалориметрия или микрокалориметрия биологических объектов. В этой области находятся тепловые потоки, возникающие в процессе жизнедеятельности микроорганизмов (0,1-100 мкм) и простейших микроорганизмов (100-1000 мкм).

     Так как различные процессы жизнедеятельности  микроорганизмов сопровождаются выделением тепла, то мерой физиологической  активности клеток с энергетической точки зрения может являться скорость их тепловыделения, которая отражает как интенсивность протекающих  метаболических реакций, так и скорость размножения клеток.

     В основе биокалориметрии, как и других косвенных инструментальных методов анализа живых организмов, лежит зависимость величины регистрируемого сигнала от численности и физиологической активности клеток в анализируемом объекте.

     Микробиокалориметрия находит практическое применение в медицине, биологии, биотехнологии, экологии. Достоинство теплометрического подхода при изучении биообъектов заключается в его универсальности и возможности применения для анализа биосистем на разных уровнях их организации – от молекул до клеточных сообществ. 
 
 
 
 

     1.4.1 Биоколориметрический метод определения содержания микроорганизмов в средах [10]

     Микрокалориметрия – одна из основных областей практического приложения микрокалориметрии. Микроорганизмы обладают высоким уровнем тепловой активности и выделяют 10^-10-10^-14 Вт/кл. При современном уровне чувствительности микрокалориметров это позволяет регистрировать 10⁴-10⁵ кл/см³ в течение часа. В сочетании с методом культивирования микроорганизмов микрокалориметрический метод способен зарегистрировать 10⁰-10¹ кл/см³, однако время анализа возрастает до 10 ч.

     Методы  микрокалориметрии позволяют не только измерить теплопродукцию отдельных видов микроорганизмов, но и изучить положительное и отрицательное влияние различных факторов на метаболизм клеток.

     Для анализа жизнедеятельности микроорганизмов  используются термограммы. Различают  дифференциальные и интегральные термограммы.

     При дифференциальной термограммой понимают зависимость мощности тепловыделения образца от времени наблюдения.

     Интегральная  термограмма отражает общее количество тепла, выделенного к определенному  моменту, как функцию времени. Микрокалориметр  непосредственно регистрирует дифференциальную термограмму, и затем рассчитывается интегральная термограмма.

     Тепловыделение  может быть обусловлено физико-химическими, биозимическими, микробиологическими процессами. В последнем случае термограмма отражает энергетический обмен микроорганизмов с окружающей средой в процессе жизненного цикла популяции клеток. Если время наблюдения ограничивается длительностью не всего жизненного цикла микроорганизмов, а только его частью (как правило, начальной стадией), то регистрируемая зависимость носит название укороченной термограммы.

     Основными параметрами дифференциальной термограммы  являются: количество и время появления  пиков, их высота, интервалы времени  между пиками. Как известно из литературы, при одинаковых условиях измерения  и в определенных питательных  средах дифференциальные термограммы  могут применяться для видовой  идентификации микроорганизмов  так же точно, как метод дактилоскопии  в криминалистике.

     Интегральная  термограмма характеризует общее  количество тепла, выделенного микроорганизмами в образце за время наблюдения. Она получается путем интегрирования дифференциальной термограммы во времени. На начальном этапе измерений  интегральная термограмма коррелирует с кривой роста численности микроорганизмов в среде. Это позволяет использовать интегральные термограммы наряду с измерением мощности тепловыделения образцов для определения общей бактериальной загрязненности пищевых продуктов.

     Количественное  определение микроорганизмов методом  микрокалориметрии основано на экспериментально установленной зависимости между количеством выделенного тепла (или мощность выделения) и численностью (биомассой) микроорганизмов. Корреляция между данными параметрами сохраняется при различных сочетаниях pH, Т и других факторов. 

     1.4.2 Оценка уровня  биологической активности  почв

     Методы  определения биологической активности почвы делят на две группы: одни позволяют измерять действительную, другие – потенциальную активность. Действительную биологическую активность измеряют в естественных условиях, в то время как потенциальную  – обычно в лаборатории, где можно  произвольно изменять внешние условия (температуру, влажность, аэрацию и  т.п.). Результаты, полученные при помощи методов, относящихся к этим двум группам, необязательно совпадают, более того, они могут быть и  противоположными.

     Методы  измерения общей биологической  активности почв нельзя назвать во всех отношениях совершенными. Например, они не позволяют определять количественные и качественные характеристики биомассы микрофлоры, в связи с чем параллельно с измерением биологической активности почвы обычно приходится выявлять и содержание в ней почвенных микроорганизмов. Другой недостаток методов состоит в том, что они не регистрируют колебания в составе микробных популяций, происходящие в результате изменений внешних условий. Так, если в почву внести ингибитор, его влияние необязательно отразится на показателях биологической активности (например, на продуцировании СО₂).

     Подавление  развития той или иной группы микроорганизмов  может сопровождаться более интенсивным  размножением конкурентных групп, и  в результате количество конечных продуктов  метаболических процессов останется  неизменным.

     Результативность  измерения в значительной мере зависит  от химических и физических особенностей почвы, поэтому их обязательно следует  учитывать при выборе метода. [10].

     Биологическую активность почв определяют, пользуясь  самыми различными микробиологическими (прямой подсчет микроорганизмов  разных групп – бактерий, актиномицетов, грибов – и определение количества микробных зачатков на разны питательных  средах), биохимическими (определение  ферментативной активности почв, АТФ, ДНК), физиологическими (физиологический  метод определения биомассы микроорганизмов, определение дыхания почв) и химическими (определение нитратов,  нитритов, аммония) методами [5].

     Все методы можно разделить на две  группы:

     1) методы определения актуальной (полевой)  биологической активности в почвах (полевые методы определения дыхания,  азотфиксации, денитрификации, некоторые изотопные методы);

     2) методы определения потенциальной  биологической активности почв, т.е. той активности, которая обнаруживается  в лаборатории при оптимальных  условиях для протекания данного  процесса (определение  ферментативной  активности почв, лабораторные методы  определения нитрификации, азотфиксации, денитрификации, интенсивности дыхания). Ко второй группе методов относятся и определение численности микроорганизмов прямыми методами или посевом, определение ДНК, мурамовой кислоты, хлорофилла, физиологический метод определения микробной биомассы, так как они позволяют определить только потенциальные возможности микроорганизмов в почве, но не дают представления об активной части микроорганизмов в определенный момент [1].

     Метод определения дыхания почвы. Определение  скорости эмиссии СО₂ из почвы в атмосферу (дыхания почвы) проводят камерно-эмиссионным методом [11].

     Изолятор  представляет собой цилиндр из нержавеющей  стали высотой 10-20 и диаметром 5-15 см. Его врезают в почву на глубину 3-5 см и выдерживают в течение 15-30 мин, отбирая в динамике пробы  воздуха из изолированного объема надпочвенной атмосферы. Для отбора проб в стальных изоляторах имеются отверстия, закрытые резиновыми пробками. Отбор производят шприцами типа «Рекорд» объемом 10-20 см . Пробы до анализа хранят в пенициллиновых или инсулиновых флакончиках с водно-солевыми (NаС1) растворами. После транспортировки в лабораторию производят определения концентрации СО₂ в пробах методом газовой хроматографии. Условия определения: детектор по теплопроводности (катарометр), колонки с носителем Раrарак-Q (0,3´350 см), газ-носитель гелий (25 мл/мин), температура колонки 40°C. Отбор газовых проб производят в динамике немедленно после установки изолятора (C₀) и дважды через равные промежутки времени t (C₁ и C₂). Величину t выбирают таким образом, чтобы она соответствовала началу замедления накопления газа в камере. Динамика накопления газа в камере зависит не только от интенсивности его выделения, но и от газопроницаемости почвы, а также от высоты изолятора. Расчет газопроницаемости (D') почвы ведут по формуле: 

                                               D’= -H/t´ln {(C₁-C₀)/(C₂-C₁)}.                                                           (13) 

     Скорость  эмиссии газа определяют по формуле: 

                                            F =D’(C₁-C₀)/ {1-ехр (-D’´t/H)}.                                                          (14) 

     Метод инициированного микробного сообщества: С помощью сканирующего электронного микроскопа в сочетании с классическими  методами микробиологии изучается  структура и особенности инициированного  субстратом сообщества почвенных микроскопических обитателей. Отмечают доминирование и соотношение отдельных групп бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей, простейших и микроскопических беспозвоночных животных [12].

     Метод заключается в следующем: нестерильную почву в воздушно-сухом состоянии  растирают в ступке, предварительно удалив крупные корешки, просеивают через сито 1 мм, увлажняют дистиллированной водой до 60% полевой влагоемкости и тщательно перемешивают. Пастообразную массу почвы вносят в маленькие чашки Петри диаметром 4 см до краев и слегка уплотняют шпателем так, чтобы образовалась ровная поверхность. На поверхность почвенной пластинки в чашке Петри наносят тонкий слой крахмала полоской в 1 см по диаметру чашки. Для этого на тонкий слой крахмала осторожно накладывают два чистых листа бумаги так, чтобы расстояние между ними было 1 см; чашку с почвой переворачивают и по диаметру чашки прикладывают на 1 с к образовавшейся полоске. Лишнее количество крахмала сдувают сжатым воздухом так, чтобы на почве осталась тонкая полоска не более двух-трех слоев крахмальных зерен. Чашки с почвой помещают в другие чашки большего размера, на дно которых налита дистиллированная вода для поддержания постоянной влажности. В таком состоянии чашки инкубируют при 25°С в термостате в течение 2-3 недель.

     За  развитием микроорганизмов на полоске  крахмала наблюдают визуально с  помощью лупы, светооптического и  сканирующего электронного микроскопов. В сканирующем микроскопе наблюдают  развитие бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей и беспозвоночных животных.

     При использовании описанного подхода  в макромасштабах воспроизводится аэробная микрозона, обогащенная органическим веществом (крахмалом). С помощью этого метода удалось установить, что обычно в заданных узких условиях процесс ведут несколько доминирующих видов.