Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну

ТП.6. Підготовка посівного матеріалу

ТП.5.1. Ведення музейної культури

Музейною культуру зберігають на скошеному агарі зі складом (кг/м3): сахарози – 30; К₂НРО₄ – 1; NaNO₆ – 2, KCl – 0,5; MgSO₄ 7H₂O – 0,5; FeSO₄ 7H₂O – 0,01; ZnSO₄ 7H₂O – 0,01 і CuSO₄ 5H₂O – 0,005  [19].

ТП.5.2. Вирощування культури в колбах на качалках

В колбу місткістю 1 л зливаємо стерильні розчини 1, 2, 3 відповідно від ДР.4.1.2., ДР.4.1.4., ДР.4.1.6. Розливаємо дане поживне середовище по 100 мл в попередньо простерилізовані качалочні колби місткістю 750 мл. В кожну колбу вносимо посівний матеріал зі скошеного агаризованого середовища ( робимо змиви культури з 12 пробірок). Процес здійснюється в стерильних умовах. Колби ставимо на качалки з частотою обертання 160 об/хв., впродовж 48 год. при температурі 24 ^оC.

Отримали 600 мл готового посівного матеріалу.

ТП.5.3. Культивування посівного матеріалу у ферментері V = 10 л

В простерилізований ферментер V = 10 л подають розчини 1, 2, 3 відповідно від ДР.4.2.2; ДР.4.2.4;. ДР.4.2.6. Потім засівають інокулятор 600 мл посівного матер´ялу, через зливний бачок в стерильних умовах (за допомогою палаючого факела). Вирощують протягом 48 годин, t = 24 ^оС,     рН = 4,5 – 5 при постійному перемішуванні. Для аерації середовища подається стиснене стерильне повітря від ДР.2.6. Відпрацьоване повітря, що виходить з ферментера, йде на знешкодження відходів.

ТП.5.4. Культивування посівного матеріалу в 100 л ферментері

У попередньо простерилізоване поживне середовище, після змішування всіх компонентів середовища, додається посівний матеріал зі стадії ТП.5. Вирощують протягом 48 годин, t = 24 ^оС і при рН 4,5 – 5 при постійному перемішуванні та аерації (стиснене стерильне повітря від ДР.2.6.) Відпрацьоване повітря, що виходить з ферментера, йде на знешкодження відходів.

ТП.6. Виробничий біосинтез

ТП  6.1. Виробниче культивування

В ферментер V = 1 м³ подаємо 60 л інокуляту від ТП. 5.4. До сорочки ферментера подають технічну воду з t = 30 ^оС для потреби регулювання необхідного температурного режиму. Для аерації подаємо через барботер стерильне стиснуте повітря ДР.2.6.

Об'єм ферментера заповнюють на 60% інокульованим середовищем. Тривалість виробничого культивування – 96 год. У процесі ферментації дозовані потоки поживних середовищ, посівного матеріалу подаються у ферментер. Із ферментера відводиться культуральна рідина, тепло, відпрацьоване повітря. В процесі виробничого біосинтезу вимірюються необхідні для Penicillium griseofulvum МТСС 2004 параметри культивування (рН, концентрація розчиненого кисню, температура). Під час ферментації кожні 4 – 8 год відбирають проби культуральної рідини та здійснюють мікробіологічний та хіміко-технологічний контроль. У процесі виробничого біосинтезу необхідним є використання стерильного поживного середовища та повітря, вибір яких зумовлений морфолого-культуральними та фізіолого-біохімічними особливостями Penicillium griseofulvum. Продуценти у вигляді суспензії певної густини подають у ферментер, в якому міститься стерильне рідке поживне середовище. При цьому у поживне середовище не повинні потрапляти сторонні мікроорганізми – усі з'єднання у системі повинні бути герметично закриті.

Температура. Важливу роль у розвитку мікоміцетів і біосинтезі гризеофульвіну має температура культивування організму. Підвищення температури вище 32˚С призводить практично до зупинки утворення антибіотика. Оптимум температури для синтезу гризеофульвіну 28˚С.

рН  середовища. Кращим початковим рН середовища для розвитку актиноміцета є рН = 4,5 - 5,5. Утворення гризеофульвіну відбувається при значенні рН, яке знаходиться між 6,5-7,2.

Аерація. Швидкість утворення антибіотика при глибинному рості мікроорганізму у 2 – 3 рази вища, ніж при поверхневому. Це пов'язано з тим, що P. griseofulvum є високо аеробним організмом. Продуцент поглинає велику кількість кисню.

6.4. Контроль виробництва

Таблиця 1

Контроль  виробництва стадій основного процесу

Номер контрольної  точки та назва стадії	Об’єкт контролю та показник що визначається	Метод контролю	Періодичність перевірки та порядок відбору  проб	Нормативна  характеристика показника, що визначається
1	2	3	4	5
ДР 1.3 Підготовка миючих та дезінфікуючих  розчинів
ДР.1.3.1      Хімічний контроль приготування розчину хлорамінуБ	Концентрація	Фізичні методи визначення концентрації	Після приготування розчинів	С = 2 %, С = 6 %
1	2	3	4	5
ДР.1.3.3.   Хімічний контроль приготування розчину каустичної соди	Концентрація	Фізичні методи визначення концентрації	Після приготування розчину	С = 2 %,
ДР.1.3.1.    Хімічний контроль приготування  76 % етилового спирту	Концентрація	Фізичні методи визначення концентрації	Після приготування розчину	С = 76 %,
ДР 1.4 Підготовка обладнання та комунікацій
ДР.1.5.2. Технологічний контроль миття обладнання	Температура; час	Візуально	Під час проведення миття	t = 60 oC           τ = 40 хв
ДР.1.5.3. Технологічний контроль герметичності обладнання	Тиск	Манометр	Після миття  та ополіскування обладнання	Р=0,5-0,6МПА, τ = 30 хв
ДР.1.5.4.  Технологічний контроль стерилізації обладнання	Режим стерилізації вузлів обладнання; тиск; температура.	Манометр технічний; Термометрі	Температура та тиск визначаються безперервно під час виробничого процесу	Р = 0,3 МПа      t = 130 oC
ДР 2 Підготовка вентиляційного повітря
ДР.2.2. Технологічний контроль після фільтру грубої очистки	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Безперервно при  подачі повітря	Е=80%
ДР.2.3. Технологічний контроль процесу стиснення повітря	Тиск; температура	Манометр; технічний  термометр	Безперервно при  подачі повітря	Р=0,35–0,5 МП t=120 - 125 oC
1	2	3	4	5
ДР.2.4. Технологічний контроль стабілізації термодинамікних показників повітря	Температура; вологість	Технічний термометр; вологовло-влювач	Безпосередньо під час подачі повітря	t = 25 − 30 ˚С, W = 40 %
ДР.2.5. Технологічний та мікробіологічний контроль стерильності повітря після тонкого очищення	Повітря;  вміст мікроорганізмі та часток	Мікробна контамінації; седимента-ційний метод визначення (седиментація на пластинку КУО/м3)	Під час кожної зміни, під час виробничого біосинтезу	Не повинно  бути життєздатних мікроорганізмів, максимально  допустиме число часток в 1м3 повітря 200. Е = 95 %
ДР.2.6. Технологічний контроль повітря після очищення на індивідуальному фільтрі	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Пезперервно при  подачі повітря	Е = 99,95 %
ДР.3. Підготовка допоміжних речовин
К.3.1.              Хімічний контроль при приготуванні соляної кислоти	Концентрація	Фізико-хімічний метод	Після приготування розчину	С = 6 %
К.3.2.           Хімічний контроль приготування розчину гідроксиду натрію	Концентрація	Фізико-хімічний метод	Після приготування емульсії	С = 10 %
1	2	3	4	5
К.3.2.1.  Мікробіологічний та технологічний контроль стерилізації розчину гідроксиду натрію	Режим стерилізації розчину; температура; час;     мікробна контамінація.	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначаються безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури. Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	t = 131 ˚С,         τ =  30 хв.       Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
ДР.4. Підготовка та стерилізація поживного середовища
ДР.4.1.1., ДР.4.2.1., ДР.4.3.1., ДР.4.4.1. Технологічний контроль зважування та приготування розчину 1	Концентрація глюкози, (лактози)	Фізичні методи визначення концентрації	Після приготування розчинів	С = 40 %
ДР 4.1.2., ДР.4.2.2., ДР.4.3.2. ДР.4.4.2. Технологічний та мікробіологічний контроль стерилізації компонентів поживного середовища	Температура; час;        мікробна контамінація	Технічний термометр; годинник; чашки Петрі	Температура визначається безперервно під час стерилізації. Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	t = 112 ˚С,       τ = 30 хв.  Після стерилізації присутність м.о. не допускається
ДР.4.1.4., ДР.4.1.6., ДР.4.2.4., ДР.4.2.6., ДР.4.3.4. ДР.4.4.4. Технологічний контроль стерилізації розчинів	Температура; час;	Технічний термометр; годинник;	Температура визначається безперервно під час стерилізації;	t = 131 ˚С,    τ = 40 хв. Після стерилізації присутність м.о. не допускається
ДР.4.4.5.     Хімічний конроль розчину	рН	рН-метр	Після стабілізації розчину	рН = 6,5 – 7,2
1	2	3	4	5
ТП 5. Підготовка посівного матеріалу
ТП.5.2. Технологічний, хімічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці	Температура; час;                 рН;         кількість  обертів; мікробна контамінація	Термометр технічний;    рН-метр; годинник;	Під час вирощування  посівного матеріалу в колбах	t = 24 °С,       pH = 4,5 – 5,    τ = 48 год,      W = 160 об/хв. Присутність сторонніх м.о. не допускається, Х = 4 г/л
ТП.5.3. Технологічний, хімічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в ферментері           V = 10 л.	Температура; Час;               рН;      кількість обертів; концентрація біомаси; мікробна контамінація	Технічний; термометр; годинник;   рН-метр;	Під час вирощування  посівного матеріалу в ферментері	t = 24 °С,       pH = 4,5 – 5,    τ = 48 год,      W = 160 об/хв. Присутність сторонніх м.о. не допускається, Х = 4 г/л
ТП 5.4. Технологічний, хімічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в ферментері     V=100 л.	Температура; час;              рН; концентрація біомаси; мікробна контамінація	Технічний термометр; годинник;    рН-метр;	Під час вирощування  посівного матеріалу в ферментері	t = 24 °С,       pH = 4,5 – 5,    τ = 48 год,      W = 160 об/хв. Присутність сторонніх м.о. не допускається, Х = 4 г/л
ТП.6. Виробничий біосинтез
ТП.6. Технологічний, хімічний та мікробіологічний контроль при виробничому культивуванні.	Температура; час;              рН; концентрація біомаси; мікробна контамінація; концентрація антибіотика	Технічний термометр;   рН-метр; годинник;	Під час вирощування  посівного матеріалу в ферментері	Т = 28 ˚С      рН = 6,5 - 7,2, τ = 96 год.      Х = 8 г/л, Сант. = 540 мг/мл. Присутність сторонніх м.о. не допускається,

 

Методики  визначення основних параметрів

Метод визначення концентрації біомаси

Визначання  біомаси проводили шляхом кількісного  вимірювання сухої маси. Центрифугування  проводять при 4000 об/хв впродовж 20 хв. Осад промивають дистильованою водою, та висушують при 105 ˚С до постійної маси [6].

Визначення концентрації джерела  вуглецю

Для культивування P. griseofulvinum MTCC 2004 використовується поживне середовище джерелом вуглецю в якому є лактоза та глюкоза.

Визначення  лактози та глюкози здійснюємо за допомогою  йодометричного методу.

Визначення лактози.

Лактоза, молочний цукор, дисахарид, утворений залишками b-галактози і a-глюкози; існує у вигляді a- і b-форм.

Принцип методу грунтується на взаємодії альдегідної  групи лактози з йодом в  лужному середовищі, де йод є окислювачем. Атомарний кисень, що виділяється при цьому, окислює лактозу в глюконову кислоту, яка в лужному середовищі утворює відповідну сіль.

Реакція йде  за наступною схемою:

2NaOH + J₂  ®  2NaJ + NaOJ + H₂O

C₁₂H₂₂O₁₁ + NaOJ + NaOH  ®  C₁₂H₂₂O₁₂Na + NaJ + H₂O

CH₂OH(CHOH)₄COH +NaOH + NaOJ  ®  CH₂OH(CHOH)₄COONa+NaJ+H₂O

Йод, який не прореагував  з лактозою, визначають в кислому  середовищі титруванням розчином тіосульфату  натрію. Ця реакція також йде у  дві стадії:

NaOJ + NaJ + H₂SO₄  ®  J₂ + Na₂SO₄ + H₂O

J₂ + 2Na₂S₂O₃  ®  2NaJ + Na₂S₄O₆

Вимірюємо з  точністю до 0,01 г 10 мл розчину, який будемо аналізувати і переносимо в мірну  колбу на 250 мл, обмиваємо склянку, в якій вимірявся аналізований розчин, дистильованою водою і переливаємо  суміш у мірну колбу. Доливаємо у мірну колбу воду до половини місткості і перемішують. Для осадження білків і жирів додаємо 10 мл розчину сульфату міді і 4 мл 1 н. розчину гідроксиду натрію, перемішуючи рідину після вливання кожного реактиву. Доводимо до мітки водою, знову перемішуємо і залишаємо відстоюватись протягом 30 хв. Відстояну рідину фільтруємо у суху колбу через складчастий фільтр, не враховуючи перші 10–20 мл фільтрату. Далі 25 мл фільтрату переносимо в конічну колбу на 250–300 мл, в другу таку саму колбу вносимо 25 мл дистильованої води (контрольний дослід). В обидві колби додаємо по 25 мл 0,1 н. розчину йоду і одразу, при постійному перемішуванні, повільно приливаємо з бюретки по 37,5 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію. Колби закриваємо гумовими пробками і витримують протягом 20 хв. у темному місці при температурі 20°С. Потім у кожну колбу вливаємо по 8 мл 0,5 н. розчину соляної кислоти і титруємо  йод, що виділився розчином тіосульфату натрію в присутності індикатору (1,0%-й розчин крохмалю).

Титрування  проводимо спочатку повільно, без індикатору, до появи світло-жовтого забарвлення розчину, потім доливаємо 1 мл індикатору і продовжуємо титрувати по краплинах до моменту, коли від однієї краплини розчину тіосульфату натрію сине забарвлення зникає.

Вміст лактози (%) обчислюють за формулою:

де 0,01801 – кількість  лактози, яка є еквівалентною 1 мл 0,1 н. розчину йоду; A і B – відповідно кількість 0,1 н. розчину тіосульфату натрію, витраченого на титрування йоду у контрольній і дослідній пробах, мл; 0,97 – поправка; n – кількість аналізую чого розчину, мл; 100 – коефіцієнт перерахунку у відсотки [5].

 

Визначення глюкози.

Глюкоза – виноградний  цукор, декстроза; відноситься до гексоз. Розчин глюкози містить молекули в a- і b-формі; рівноважний стан досягається при співвідношенні цих форм 37% і 63%. Глюкоза оптично активна, обертає поляризований промінь вправо.

Принцип методу ґрунтується на здатності йоду в  лужному середовищі окислювати тільки альдози, не впливаючи на кетози. Йод, який не прореагував з глюкозою, визначають в кислому середовищі титруванням розчином тіосульфату натрію.

У мірну колбу 100 мл відміряємо 10 мл аналізованого  розчину та доводимо до мітки водою. Вміст колби фільтруємо, з прозорого  розчину в колбу Ерленмейера  відбираємо 10 мл.

В колбу додаємо 25 мл 0,1 н. розчину йоду і через 2–3 хв. при енергійному перемішуванні повільно додаємо 35 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію до зникнення забарвлення. Колбу закриваємо гумовою пробкою і витримуємо 20 хв. в темному місці. Потім додаємо 5 мл 1 н. розчину сірчаної кислоти і титруємо йод, що виділився, 0,1 н. розчином тіосульфату натрію, додаючи в кінці титрування розчин індикатору (1,0%-й розчин крохмалю).

Одночасно проводять  контрольний дослід з 10 мл дистильованої  води.

Кількість глюкози (%) обчислюють за формулою:

.

де А і В – відповідно кількість тіосульфату натрію, витраченого на титрування контрольної і дослідної проб, мл; 0,009 – кількість глюкози, еквівалентна 1 мл 0,1 н розчину йоду, г/мл; п – кількість аналізуючого розчину, мл; V₁ – об’єм загального розчину, мл; V₂ – об’єм, взятий для титрування, мл; 100 – коефіцієнт перерахунку у відсотки [5].

 

Визначення концентрації джерела  азоту

Метод визначення концентрації загального азоту методом К`єльдаля

Метод Кьєльдаля  дуже поширений і включає перевод органічного та неорганічного азоту в амонійну форму і наступне визначення концентрації іонів амонію. Метод К’єльдаля оснований на тому, що органічні азотвмісні сполуки розкладаються сумішшю концентрованої сірчаної кислоти та сульфату калію при 315 – 370 ^оС в присутності каталізатора: солі міді, ртуті або металевого селену:

Принцип методу – пробу культуральної рідини спалюють концентрованою сірчаною кислотою за присутності мідно купоросу, як каталізатора, пореводячи всі з`єднання азоту сірчанокислий амоній (NH₄)₂SO₄. Потім пробу кількісно переносять в колбу для перегонки. З надлишком лугу відгоняють виділений аміак, який поглинаеться титруванням розчину соляної кислоти.

5 мл відфільтрованого  середовища поміщують в колбу К`єльдаля для спалювання, додають 15мл концентрованої сірчаної кислоти, 0,5 г мідного купоросу та 2 г калію сірчанокислого. Пробу спалюють до появи блакитно-зеленого кольору. Охолоджену пробу кількісно переносять в колбу для перегонки, додають 40 – 50 мл 40%-го розчину їдкого натрію, аміак що виділяється відгоняється на протязі 40 – 50 хвилин в збірник з 10 – 20 мл 0,1н розчину соляної кислоти. Індикатор – метилоранж.

Надлишок соляної  кислоти відтитровують 0,1 н розчином їдкого натрію. Відгонку ведуть через  каплеуловлювач.

Розрахунок:

                                (У₁-У₂) 1,4

(Азот) мг/мл =

                                       е

Де: У₁ – кількість мл 0,1н розчину соляної кислоти, взятої для визначення;

 У₂ – кількість мл 0,1 н розчину їдкого натрію,використаного на титрування надлишку соляної кислоти;

1,4 – кількість  мг азоту, відповідна 1 мл 0,1н розчину  соляної кислоти; [5].

Мікробіологічний контроль

В першу чергу, перевірка чистоти культуральної  рідини проводиться з використанням методу мікроскопіювання, результати методу будуть позитивними, якщо виявленими будуть лише клітини P. griseofulvinum. Проте не завжди вдається отримати точні результати за даним аналізом, оскільки деякі мікроорганізми мають дуже малі розміри. Тому наступною стадією є виділення ізольованих колоній на чашках Петрі з м'ясо-пептонним агаром (МПА − для бактерій) та сусло-агаром (СА − для грибів і дріжджів).

Необхідно провести контроль в колбах на качалках (ТП 5.2.) та в ферментерах об’ємом 10 л, 100 л (ТП 5.3. та ТП 5.4) та на етапі виробничого біосинтезу ТП 6.1.

Аналіз проводиться в стерильних умовах в боксі. Посівний матеріал розподіляють по всій поверхні поживного середовища. Посіви на МПА інкубують при 35 °С, а на СА – 24 °С.

Висів на поживне  середовища Сабуро проводять методом  мембранної фільтрації. 1,0 г препарату вносять і стерильний флакон місткістю 250 мл і доводять об’єм стерильним фосфорним буфером, до 100 мл.

В 1 г препарату  допустима наявність не більше 10³ бактерій або 10² грибів, також не допускається наявність бактерій роду Enterobacteriaceae, Pseudomonasaeruginosa та Staphylococcusaureus.