Біосинтез ціанкобаламіну штамом бактерії Pseudomonas denitrificans

Потреби для синтезу біомаси(вуглець). У біомасі міститься 50% вуглецю, отже вміст вуглецю у 45 г біомаси становить 45×0,5=22,5 г. Ця кількість вуглецю міститься у (45×60)/40=67,5 г цукрів.

 У перерахунку  на мелясу одержемо 135 г/л. Враховуючи 40% втрат субстрату на «холосте  окислення», для одержання 45 г/л  біомаси у середовище необхідно  внести (135×0,4)+135=189 г/л меляси (18,9%).

Отже, загальний  вміст меляси у середовищі, необхідний для синтезу біомаси (45г/л) та ціанкобаламіну (60 г/л) становить 252 + 189=441 г/л = 44%.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення

Потреби для синтезу біомаси

Припустимо, що у біомасі міститься 10% азоту. Таким чином, у 45 г біомаси вміст азоту (за елементом N) становить 4,5 г.

Продуцент ціанкобаламіну асимілює як джерело азотного живлення мінеральний та органічний азот. Для одержання вітаміну В₁₂ в промислових умовах використовують середовище, яке містить (NH₄)₂НРО₄ .

Розрахуємо кількість (NH₄)₂НРО₄, необхідну для одержання 45 г/л біомаси. Молекулярна маса (NH₄)₂НРО₄ становить 132. Отже, у 45 г/л (NH₄)₂НРО₄ міститься 28 г азоту (N), тоді 4,5 г азоту буде міститись у (132×4,5)/28=21,21 г солі.

Для одержання 45 г/л біомаси вміст (NH₄)₂НРО₄ у середовищі культивування повинен становити 21,21 г/л.

Потреба для синтезу  ціанкобаламіну. Азот входить до складу вітаміну В₁₂. Розрахуємо вміст (NH₄)₂НРО₄ у середовищі, необхідний для одержання 60 г/л ціанкобаламіну.

Молекулярна маса ціанкобаламіну становить 1355. У 1355 г ціанкобаламіну міститься 196 г азоту (N), тоді у 60 мг ціанкобаламіну вміст азоту становить (60×196)/1355=8,68 г.

Далі розраховуємо, в якій кількості (NH₄)₂НРО₄ міститься ці кількості азоту. У 132 г (NH₄)₂НРО₄ міститься 196 г азоту (N), тоді 8,68 г азоту буде міститись у (132×8,68)/196=5,8 г солі.

Для одержання 60 г/л ціанкобаламіну вміст (NH₄)₂НРО₄ в середовищі повинен становити 5,8 г/л.

Розрахунок  вмісту органічного азоту в мелясі. Для одержання ціанкобаламіну використовується ауксотрофний мутант Pseudomonas denitrificans. Оскільки меляса багата бетаїн та глутамінову кислоту, що надають позитивний ефект на вихід вітаміну. ​​Бетаїн стимулює синтез б-АЛК і, можливо, також змінює проникність мембрани тому її вносять в середовище екзогенно.

Амінний азот входить  до складу меляси ( 0,5% до маси сухих  речовин). Розрахуємо кількість азоту, що міститься в 441 г меляси. Вміст сухих речовин у мелясі становить 75%, тобто у 441 г меляси міститься 441×0,75= 330 г сухих речовин. Отже, вміст амінного азоту у мелясі становить

( 0,5×330)/60=2,75 г.

Розрахунок вмісту магнію у середовищі

У біомасі міститься  близько 1% магнію (за елементом Мg). Отже для синтезу 45 г/л біомаси вміст магнію у середовищі повинен становити 45×0,01=0,45 г/л.

Джерелом магнію у промисловому виробництві ціанкобаламіну є МgSO₄, у кількості 3 г. Вміст магнію у МgSO₄ становить 24/120=20%.

Отже можемо записати 2×Х=0,45, звідки Х=0,225. Відповідно концентрація становить (120×0,1)/24=1,125 г/л.

Отже середовище для культивування продуцента НАД містить 1,125 г/л Мg.

Розрахунок вмісту сірки в середовищі

У біомасі міститься  близько 1% сірки (за елементом S). Отже для синтезу 45 г/л біомаси вміст сірки у середовищі повинен становити 45×0,01=0,45 г/л.

Джерелом сірки у промисловому виробництві ціанкобаламіну є МgSO₄, у кількості 3 г. Вміст сірки у МgSO₄  становить 32/120=26%.

Отже можемо записати 2,6×Х=0,45, звідки Х=0,17. Відповідно концентрація становить (132×0,17)/32=0,7 г/л.

Сірка входить  не тільки до складу МgSO₄, а ще й MnS0₄.

Отже для синтезу 45 мг/мл біомаси вміст сірки у середовищі повинен становити 45×0,01= 0,45г/л. MnS0₄ міститься у кількості 0,2 г. Вміст сірки у MnS0₄ становить 32/151=22%.

Отже, можемо записати 2,6×Х=0,45, звідки Х=0,17, відповідно концентрація становить (151×0,17)/32=0,8 мг/мл.

Отже загальна кількість сірки у середовищі становить – 0,7+0,8=1,5 г/л.

Розрахунок  вмісту натрію у середовищі

У біомасі міститься  близько 1% магнію (за Na елементом). Отже для синтезу 45 мг/мл біомаси вміст магнію у середовищі повинен становити 45×0,01=0,45 г/л.

Джерелом натрію  у промисловому виробництві ціанкобаламіну є Na₂MoO₃, у кількості 5 г. Вміст мангану у Na₂MoO₃ становить 23/190=11%.

Отже можемо записати 1,1×Х=0,45, звідки Х=0,4. Відповідно концентрація становить (190×0,4)/23=3,3 г/л.

Отже середовище для культивування продуцента ціанкобаламіну містить 3,3 г/л Na.

4.5. Обгрунтування способу проведення біосинтезу

Процес отримання ціанкобаламіну здійснюють методом глибинної ферментації, як трьохстадійний. Ферментацію здійснюють на круговій качалці в колбах Ерленмейєра. На першій стадії накопичується біомаса, культуру зберігають у ліофілізованому стані, а потім пересівають в пробірку з щільним середовищем. Інкубують 4 доби і потім переносять на нове поживне середовище того ж складу і в літрову колбу Ерленмейера і інкубують 3 доби на качалці. Далі клітини переносять в ферментер і культивують там 90 годин. Виділення, очистку ціанкобаламіну із культуральної рідини здійснювали за допомогою методів ультрафільтрації, екстракції та осадження.

Як продуцент  використовували культуру Pseudomonas denitrificans М-2436, яку вирощували на поживному середовищі, яке містило: вуглець, азот, магній, натрій, стимулятори росту. При цьому джерела вуглецю і азоту вносили по мірі їх вичерпування в поживному середовищі. Подальше культивування проводять підтримуючи рН в середовищі 7,0-7,2 , на протязі 90 год до досягнення максимальної кількості ціанкобаламіну в середовищі. Культивування в таких умовах дозволяє стабільно отримати високий вихід ціанкобаламіну (59-60 мг/мл).

 

4.6. Обгрунтування  вибору ферментаційного обладнання

Культивування Pseudomonas denitrificans передбачається здійснювати глибинним способом в ферментерах. Основними вимогами до ферментерів є можливість проведення процесу культивування продуцента в асептичних умовах при інтенсивній аерації середовища. Існуючі промислові ферментери за способом підведення енергії на аерацію та перемішування можна розділити на три групи: апарати з механічним перемішуванням та барбатажем (комбінований підвід енергії); з ежекційною системою аерації (підвід енергії до рідкої фази) та барботажні (підвод енергії до газової фази).

В представленій  роботі передбачено використання ферментеру з механічним перемішуванням барботажного типу. Проведення культивування Pseudomonas denitrificans на середовищах із мелясою (джерело вуглецю) передбачає забезпечення інтенсивного перемішування та аерації середовища.  В обраному ферментері достатній рівень масообміну досягається встановленням закритих та відкритих турбінних мішалок та повітря, яке подається через барботер. Застосування відкритої турбінної мішалки розташованої над барботером також забезпечує високий рівень диспергування повітря, сприяючи збільшенню поверхні контакту фаз та коефіцієнту масо передачі.

На відміну  від барботажних та барботажно – ерліфтних ферментерів, запропонований для використання апарат має високі масообмінні характеристики по кисню, в ньому можна легко варіювати режими перемішування та масообміну, суттєво меншими є витрати стерильного повітря, порівняно велика величина робочого об'єму, забезпечується рівномірний розподіл мікроорганізмів та компонентів поживного середовища (забезпечується оптимальний рівень гомогенізації).

Для забезпечення стерильності процесу ферментації в обраному ферментері передбачено використання торцевих ущільнень валу перемішуючого пристрою з паровим захистом. За допомогою застосування такої конструкції вдається практично повністю запобігти потраплянню атмосферного повітря в апарат, що є дуже важливим для збереження асептичних умов культивування.

Ферментер цього  типу являє собою вертикальний апарат, циліндричної форми, виготовлений із сталі  Х18Н10Т чи біметалу з еліптичною кришкою  і днищем. Відношення висоти до діаметру становить 2,6:1. На кришці апарату розміщений привід перемішуючого пристрою, штуцери для завантаження поживного середовища, посівного матеріалу, подачі і відведення повітря, оглядові вікна та штуцери для пристроїв візуального контролю[11].

Рис. 4.1. ферментер об'ємом 0,1 м³ для глибинного культивування мікроорганізмів:

1 — корпус; 2 — парова рубашка; 3 — барботер; 4 — мішалка; 5 — відбійник; 6 —  электропривід; 7 — завантажувальний  люк.

 

 

Розділ 5. Характеристика біологічного агента

5.1. Морфолого-культуральні  ознаки

Pseudomonas – рід бактерій типу протеобактерій, грамнегативні, що об’єднуються в родину Pseudomonadaceae. Назва родини походить від двох грецьких коренів: «псевдо» - подібний і «монас» - назва групи найпростіших з полярно розташованими джгутиками. Одним з представників цієї родини є Pseudomonas denitrificans.

Рис 5.1. Бактерія Pseudomonas denitrificans

Pseudomonas denitrificans  - це прямі або злегка вигнуті, але не спіральні палички 0,5-1 х 1,5- 5 мкм. Грамнегативні .Клітини в культурах часто об'єднуються в невеликі грудочки або зерна, оточені товстою слизовою оболонкою, іноді різко окресленою, - зооглеї. Чохлів не утворює, стадії спокою не відомі .Рухаються за рахунок  одного або кількох полярних джгутиків( один або цілий пучок  на одній або обох кінцях клітини); в окремих випадках нерухомі. В деяких видів можливе також утворення латеральних джугитків з коротшою довжиною хвилі[7].

 

5.2. Фізіолого-біохімічі  ознаки

Хімічний склад  клітинної стінки бактерій постійний  і, як правило, не змінюється на різних стадіях розвитку культури або при  виникненні мутацій.  Відсоток Г + Ц (гуанін - цитозин) в ДНК коливається в межах 58-69%. Аероби; метаболізм дихального типу з використанням кисню в якості кінцевого акцептора електронів; в деяких випадках термінальним акцептором електронів може служити нітрат, що забезпечує анаеробний ріст. Особливостями, що використовуються у клінічному тестуванні, є: неутворення газу з глюкози, глюкоза окислюється у випробуванні на анаеробне дихання використовуючи тест Х'ю і Лейфсона, позитивні на каталазу і оксидазу, більшість виробляють розчинний у воді блакитний пігмент піоціанін, гемолітичні на агарі крові, позитивні на каталазу, негативні на інодол і метиловий червоний, негативний тест Вождеса-Проскауера, на утворюють ксантомонадини. У багатьох видів накопичується в якості додаткового джерела вуглецю полі-β-гідроксибутират, який видно після фарбування. Більшість, якщо не всі, види не ростуть в кислому середовищі ( рН 4,5). Більшість видів органічних факторів росту не потребують. Хемоорганотрофи (деякі види - факультативні автотрофи, здатні використовувати в якості джерела енергії  Н₂ або СО₂). Використовує вуглекислий газ в якості прямого джерела вуглецю. Цей мікроорганізм  широко поширені в природі.

Pseudomonas denitrificans  природно стійкі до пеніциліну і більшісті бета-лактамових антибіотиків, але чутливі до таких антибіотиків як піперацилін, імпенем, тобраміцин та ципрофлоксацин. Клітинна стінка містить поріни. Їх опір більшості антибіотиків приписується так званим ABC-транспортерам, які викачують деякі антибіотики до того, як вони встигають подіяти.

 Бактерію можна зустріти в повітрі, грунті, морських і прісних водоймах, стічних водах та мулі, нафти і на газових родовищах. Псевдомонади були виявлені на харчових продуктах, тілах тварин, рослинах, а також у гнійних ранах і екскрементах хворих ссавців.

Деякі види патогенні  для людей, тварин і рослин.

 

5.3. Таксономічний  статус

Згідно з  ІХ виданням Керівництва Бергі з систематики бактерій (фенотипова систематика) Pseudomonas denitrificans відносять до

Царство: Вacteria

Тип: Proteobacteria

Клас: Gamma Proteobacteria

Порядок: Pseudomonadales

Родина: Pseudomonadaceae

Рід: Pseudomonas

Вид: Pseudomonas denitrificans

 

Положення згідно “Prokaryotes” (1999 – 2001 рр., філогенетична класифікація) рід Pseudomonas відносять до групи грам негативних бактерій, яка у 1988 році була об’єднана в клас Proteobacteria, який нині містить поки умовні підкласи «альфа», «бета», «гамма» та «дельта». Рід Pseudomonas  належить до Гамма-підкласу[13].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу ціанкобаламіну

6.1. Характеристика  сировини, матеріалів, напівпродуктів

Найменування	Категорія та номер  НТД	Показники НТД, обов'язкові для перевірки	Особливі властивості
1	2	3	4

Діючі речовини

Меляса ч.д.а., х.ч., Фарм.	ГОСТ 30561-98	Опис, розчинність, кількісне визначення, втрата в масі при висушуванні	Для приготування середовища
Дріжджовий  екстракт	ТУ І-ОП-332-69	Опис, розчинність, кількісне визначення, втрата в масі при висушуванні	Для приготування середовища
(NH4)2НРО4	ГОСТ 8515-75	Опис,прозорість, кольоровість	Для приготування середовища
MgSO4	ГОСТ 4523-77;	Опис,прозорість, кольоровість	Для приготування середовища