Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

Следовательно, в стволовых клетках проявля­ется общий принцип онтогенеза - функция генов с "опережением", т.е. синтез тех матричных РНК, которые будут "нужны" (будут "работать") на стадиях развития, порою значительно более позд­них. Анализ поведения стволовых клеток в культу­ре тканей позволил выявить ключевые гены генные сети, участвующие в спецификации этих клеток, в их развитии в том или ином направле­нии.

1.6. Стволовые клетки, перспектива использования в медицине

По мере углубления наших знаний об СК от­крываются новые перспективы для фундамен­тальных и клинических исследований. Различные типы СК уже находят свое применение в работах по генетике, эмбриологии, в изучении роли фак­торов роста и цитокинов, фармакологии, токси­кологии, трансплантологии. Плюрипотентность СК, их способность к самоподдержанию и мигра­ции, а также к смене программ развития и к кон­текст-зависимой дифференцировке (независимо от механизмов последних) дает им решающие преимущества по сравнению с дифференцирован­ными клетками для применения в регенератив­ной медицине. Детальное понимание биологии СК важно при их использовании в регенератив­ной медицине для восстановления поврежденных тканей путем трансплантации клеток или создания биоискусственных тканей. Кроме того, изучение СК также необходимо для еще одного направле­ния регенеративной медицины - стимуляции реге­нерации in vivo с использованием естественного потенциала локализованных в тканях СК.

                    Существующие данные позволяют предпола­гать, что многие, если не все, типы СК могут при­меняться в регенеративной медицине. Важно определить приоритетные направления использования разных типов СК в терапии тех или иных заболе­ваний. По-видимому, ЭСК человека, вследствие их тотипотентности и возможности размножения в культуре, могли бы представлять собой наиболее перспективный инструмент для регенеративной медицины. К сегодняшнему дню накоплен доста­точный опыт применения ЭСК на моделях жи­вотных для лечения заболеваний, связанных с разрушением или дисфункцией специфических типов клеток. К числу этих заболеваний, в част­ности, принадлежат сахарный диабет типа I, при котором нарушается нормальная работа островковых клеток поджелудочной железы, и болезнь Паркинсона, при которой разрушаются дофаминэргические нейроны в определенной зоне головно­го мозга. Исследования, проведенные на животных, показали, что трансплантация ЭСК эффективна в случае различных хронических заболеваний: трав­матических повреждений спинного мозга, дегене­рации клеток Пуркинье, повреждений клеток пе­чени, мышечной дистрофии Дюшенна, наруше­ний остеогенеза. Следует, однако, сказать, что для успешного применения ЭСК необходимо решить проблему гистосовместимости транс­плантата и реципиента. Предполагаемое ра­дикальное решение этой проблемы, а именно, так называемое терапевтическое клонирование, свя­зано с трансплантацией клеточного ядра реципи­ента в яйцеклетку. Это делает всю процедуру чрезвычайно сложной и дорогостоящей, хотя и позволяет получить ЭСК, генетически практиче­ски идентичные клеткам реципиента. Следует, кроме того, подчеркнуть, что ЭСК, введенные в организм, способны к образованию тератом. Та­ким образом, для применения в клеточной тера­пии необходимо проводить дифференцировку и удалять некоммитированные ЭСК, что еще более усложняет процедуру. Нельзя также игнориро­вать этические осложнения, связанные с необхо­димостью разрушения бластоцисты для получения линии ЭСК. Наконец, озабоченность по поводу возможных негативных последствий вызывают сообщения о различных патологиях у животных, полученных с помощью ядерной трансплантации.

Клиническое применение стволовых клеток крови (СКК) связано, преж­де всего, с заболеваниями крови. Общеизвестно применение трансплантации костного мозга для лечения лейкозов и лимфом. В последнее время с этой же целью успешно применяют пуповинную кровь, а также периферическую кровь после так называемой мобилизации СКК из костного мозга с помощью, например, введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. СКК также могут применяться для лечения ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда.

Значительный интерес для регенеративной медицины представляют мезенхимные стволовые  клетки (МСК) костного мозга.

Убедительно показанный на животных значительный дифференцировочный и пролиферативный потенциал МСК дает право признать за ними очень большие возможности для научного и практического применения и, вероятно, позволит этим клеткам конкурировать с ЭСК в решении многих медицинских проблем. Применение ауто-трансплантации МСК кажется наиболее перспек­тивным на данном этапе развития клинической науки, так как оно позволяет избежать этических и иммунных проблем, связанных с транспланта­цией от донора к реципиенту. К настоящему вре­мени уже накоплен значительный опыт транс­плантации костного мозга. Одна из наиболее важных областей применения МСК - репарация костных тканей, особенно с учетом того, что соб­ственные репаративные процессы в этих тканях заторможены из-за малого количества в них сосу­дов (Ballas C.B., et al., 2002). Как правило, для лечения дефектов костей применяются различные биоинженерные тканевые конструкции на основе органического поддерживающего матрикса, в который внедря­ются МСК (Awad H.A., et al., 2000). Потенциал МСК позволяет использовать их в лечении генетически обуслов­ленных дегенеративных заболеваний скелета. В частности, применение МСК апробировано в клинике для лечения нарушения остеогенеза у де­тей, вызванного мутацией гена, кодирующего коллаген типа I.

Способность МСК дифференцироваться в эндотелиальные клетки сосудов, мышечные клетки и кардиомиоциты определила возможность ис­пользования их в терапии ишемической болезни. Ишемическая болезнь сердца и, как ее следствие, инфаркт миокарда - наиболее распро­страненные заболевания в развитых странах. Ишемия конечностей только в США вызывает необходимость ампутации у 150000 человек еже­годно.  Ишемия головного мозга и острое на­рушение мозгового кровообращения чаще всего приводят к частичной или полной потере трудо­способности. В основе всех этих недугов лежит полная или частичная непроходимость сосудов вследствие различных заболеваний, в основном атеросклероза, что приводит к недостаточному кровоснабжению и к повреждению тканей. Од­ним из путей лечения может быть стимуляция об­разования новых сосудов (коллатералей) в обход поврежденных. Клетки костного мозга и культи­вированные МСК, как показано во множестве ра­бот на животных, представляют на сегодня наи­более эффективный материал для транспланта­ции с целью терапии ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, а также ишемии ко­нечностей и головного мозга. В послед­нее время появились первые сообщения об ус­пешных преклинических испытаниях аутологичной моноядерной фракции клеток костного мозга для лечения инфаркта миокарда и ишемии конечностей. Следует, однако, отметить низ­кий процент приживаемости МСК при транс­плантации, особенно после культивирования, что заставляет искать более эффектив­ные пути внедрения МСК в поврежденные ткани.

Применение СК рассматривается сегодня в ка­честве наиболее перспективной стратегии кле­точной терапии. Весьма интересной представля­ется возможность использования этих клеток в качестве первичных реципиентов рекомбинант-ной ДНК ex. vivo при генотерапии наследственных и приобретенных заболеваний. Такой путь может во многом уменьшить риск прямого введения ДНК в организм человека. Есть серьезные основания предполагать, что комбинированная геноклеточная терапия не только безопаснее, но и эффективнее раздельного применения данных подходов к терапии различных наследственных и дегенеративных заболеваний.

СК только начинают применяться в клиничес­кой медицине. Очевидно, что для их использова­ния требуется решение многих этических и науч­ных проблем.

Несмотря на обширность нерешен­ных проблем, общее мнение исследователей и врачей состоит в том, что изучение биологии СК необходимо для глубокого понимания механиз­мов регенерации и поддержания гомеостаза орга­низма, а применение СК имеет блестящие пер­спективы, и несомненно окажет самое серьезное воздействие на облик медицины будущего.

1.7. Генная  терапия

1.7.1. Понятие  о генной терапии

                    Под генной терапией подразумевают медицинский подход, основанный на введении в клетки и организм генных конструкций с лечебной целью (Culver K.W., Gene Therapy 1996, А.В. Зеленин, 2000, Wolff J.A., Lederberg L, 1994). Желаемый эффект достигается либо в результате экспрессии (работы) интродуцированного (введенного) гена, либо за счет частичного или полного подавления функции поврежденного или сверх-экспрессирующего, то есть работающего с вредной для организма интенсивностью, гена. В последнее время осуществляются также попытки коррекции структуры и функции неправильно функционирующего ("больного") гена. Следует специально подчеркнуть, что генная терапия ставит целью лечение не генов, как это иногда считают.

Идеи о возможности введения в организм генов с лечебной целью были высказаны еще в начале 60-х годов минувшего века, однако реальные попытки такого рода относятся к концу 80-х годов и практически совпадают с развитием работ по тотальному секвенированию генома человека и созданию международной программы "Геном человека".

                    В 1990 г. была осуществлена попытка лечения тяжелого, обычно несовместимого с жизнью наследственного иммунологического заболевания (иммунодефицита), вызванного дефектом в гене, который кодирует синтез фермента аденозиндезаминазы (ADA). У двух девочек в возрасте до четырех лет, страдавших врожденным дефектом в гене ADA, были взяты клетки костного мозга и перенесены в так называемую культуру, то есть для них были созданы условия роста вне организма. В эти клетки ввели ген ADA. Затем трансфицированные клетки были размножены в культуре, после чего введены больным, от которых они были получены. Авторы сообщили о четко выраженном лечебном эффекте (Culver K.W., Gene Therapy 1996).

                    Современные исследования в области генной терапии могут быть разделены на ряд относительно независимых этапов: разработка генных конструкций, проведение на экспериментальных животных так называемых предклинических испытаний и, наконец, осуществление прямых попыток лечения отдельных болезней. Шесть престижных международных журналов целиком посвящены проблемам генной терапии. Ежегодно проводятся десятки международных конгрессов и конференций. В то же время реальные успехи генной терапии в лечении конкретных больных достаточно скромны, и генная терапия все еще находится в стадии накопления данных и развития новых технологий.

1.7.2. Условия  проведения генной терапии

                    Необходимым условием генной терапии является введение генных конструкций в клетки. Как правило, в качестве лечебного препарата используется отрезок ДНК, содержащий в своем составе избранный ген. Это может быть просто кусок ДНК, не обработанный никаким специальным образом. Часто его называют "голой ДНК", которую обычно вводят в комплексе с различными липидами, белками и другими носителями, иногда синтетическими. Но чаще всего ДНК помещают в состав специальных генетических конструкций (векторов), созданных на базе разнообразных вирусов человека и животных. С этой целью над молекулой вируса производят генно-инженерные манипуляции, приводящие к удалению из нее части генов, необходимых для размножения вируса. Это, с одной стороны, лишает вирусы их инфекционности и делает их безопасными (или почти безопасными), а с другой, освобождает место для генов, предназначенных для введения в организм. Важно, что вирусные векторы сохраняют свою природную способность легко и быстро распространяться в организме, проникать в клетки и ядра и во многих случаях встраиваться в собственную ДНК клеток.

Векторы создаются на базе различных вирусов. В 40% случаях используются аденовирусы, включая делетированные, в 30% - ретровирусы, в 16% - аденоассоциированные вирусы, в 10% - вирус простого герпеса, в 4% - лентавирусы, вирус папилломы, гибридные вирусные конструкции, в том числе на базе вируса простого герпеса и аденоассоциированного вируса. Вирусы различаются способностью встраиваться или не встраиваться в геном и соответственно длительной или кратковременной экспрессией в клетках, а также специфичностью (тропизмом) к определенным тканям и органам.

Существуют также генные конструкции, рассчитанные на подавление генетической функции (Culver K.W., Gene Therapy 1996, Agrawal S., Kandimalla E.R., 2000). Они обычно нацелены на выключение функции информационной РНК (иРНК), кодирующей белок, синтез которого намечено подавить. Синтезируется комплементарная цепь нуклеотидов, которая, соединившись с иРНК, подавляет ее способность служить в качестве матрицы для синтеза белка. В связи с обратным по отношению к иРНК расположением в ней нуклеотидов такая конструкция носит название антисмысловой РНК (antisence RNA). При своей кажущейся простоте метод имеет много проблем и ограничений: вводимая конструкция должна быть нечувствительной к действию ферментов, расщепляющих нуклеиновую кислоту (нуклеаз), и легко доставляться в необходимом количестве в клетку; образовавшийся с РНК комплекс должен быть стабильным в течение времени, достаточного для реализации лечебного эффекта, и т.д. Часть этих задач решается путем создания "защищенных" аналогов нуклеотидов. Антисмысловые конструкции вводятся в организм либо непосредственно (в виде "голой" нуклеиновой кислоты), либо в составе вирусного вектора.

                    Критическим условием генной терапии является проникновение лечебного вектора в клетку, в подавляющем большинстве случаев в ее ядро. При этом необходимо, чтобы генная конструкция достигала именно тех клеток, которые нуждаются в коррекции. Поэтому успех генной терапии во многом зависит от выбора оптимального или, по крайней мере, удовлетворительного способа введения генных конструкций в организм.

                    Проще всего обстоит дело с вирусными векторами, которые, подобно их вирусам-прародителям, распространяются в организме и проникают в клетки. Такие конструкции обычно вводятся внутрисосудисто, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. Во многих случаях используются дополнительные способы повышения эффективности трансфекции, основанные на применении липосом, катионных липидов с образованием ДНК-липидных комплексов или комплексов ДНК с поликатионами (например, с полилизином).

                    Разработаны методы введения в организм генных конструкций, обеспечивающих трансфекцию необходимых клеточных и тканевых элементов. Эти методы в основном используются при работе с невирусными векторами, которые не обладают способностью к самостоятельному распространению в организме и проникновению в трансфицируемые клетки. Однако в некоторых случаях более эффективной оказывается "целевая доставка" генных конструкций, чтобы обеспечить (по крайней мере, до определенной степени) органную и тканевую специфичность генно-терапевтических процедур, снизить общую дозу вводимой чужеродной ДНК, повысить вероятность правильного встраивания в геном (например, при работе с ретровирусными векторами). Среди способов направленного введения генных конструкций выделим следующие.

Прямая инъекция генетического материала - самый простой метод доставки трансгена (введенного гена) в клетки in vivo, при котором ДНК вводится непосредственно в ткань путем инъекции. Область использования данного метода ограничена такими тканями, как кожа, тимус и поперечно-полосатые мышцы, некоторыми, так называемыми солидными (растущими плотным узлом) опухолями, причем достаточно продолжительная (до года) экспрессия трансгена наблюдается преимущественно в мышечной ткани. Эффективность такой трансфекции обычно низкая (менее 1 %), но вполне достаточная, например, для генетической иммунизации.

Баллистическая трансфекция основана на обстреле органов и тканей микрочастицами тяжелых металлов (золото, вольфрам), покрытых плазмидной ДНК (А.В. Зеленин, 2000). Микрочастицы проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядра клеток. Созданная для этой цели "генная пушка" (gene gun) по своему устройству сходна со стрелковым оружием. Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика - до 1 мм, поэтому метод используется преимущественно для трансфекции клеток кожи или подлежащего хряща. Однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить ген в волокна поперечно-полосатых мышц.