Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

                    Введение генетического материала внутрь кровеносных сосудов, питающих трансфицируемый орган. Этот подход находит применение в первую очередь для лечения болезней печени.

Введение генетического материала в почку путем инъекций в питающие кровеносные сосуды, в почечную паренхиму и мочевыводящие пути.
                    Аэрозольное введение генетического материала в дыхательные пути используется для лечения заболеваний легких.

                    Генная терапия ех vivo, или другими словами, генетические манипуляции с клетками, выделенными из организма, и введение их обратно в организм больного. Близок к генной терапии ех vivo подход, основанный на введении в организм больного клеток здорового человека или животного, содержащих нормально функционирующий ген, отсутствующий или поврежденный у пациента. Однако здесь речь идет, скорее, не о генной, а о клеточной терапии, или трансплантологии.

1.7.3. Проблемы  генной  и   клеточной  терапии

                    Плюрипотентность и  мультипотентность (могут дать начало разнообразным клеточным типам, относящимся к различным органам)  стволовых  клеток  делает  их идеальным  материалом  для  использования  в  трансплантационных  методах клеточной  и  генной  терапии.   При  этом  следует  учитывать  то, что наряду  со  стволовыми  клетками,  которые при  повреждении   тканей соответствующего органа мигрируют  к зоне повреждения,  делятся и дифференцируются,  образуя в этом месте новую ткань, существует и “центральный склад запчастей” - стромальные клетки костного мозга. Эти клетки  универсальны, они,  по-видимому (полученные многочисленные данные  такого  рода  все  же  требуют  дополнительной  проверки),  способны поступать с кровотоком в поврежденный  орган или ткань, и на месте под влиянием различных сигнальных веществ дают  начало  нужным специализированным клеткам, которые замещают погибшие.    В частности,  установлено,  что  введение  стромальных клеток костного мозга в зону повреждения сердечной мышцы (зону  инфаркта) устраняет явления постинфарктной сердечной недостаточности у экспериментальных  животных. Так, стромальные клетки,  введенные  свиньям с экспериментальным инфарктом, уже через восемь недель полностью перерождаются в клетки сердечной  мышцы, восстанавливая ее  функциональные свойства.

                    Результаты  такого лечения  инфаркта  впечатляющи. По данным Американского кардиологического общества за 2000 год у крыс с искусственно вызванным инфарктом 90% стромальных клеток костного мозга,  введенных в область сердца,  трансформируется в клетки сердечной мышцы.

                    Широко используется терапия  стромальными клетками в ортопедии. Это связано с  существованием  особых белков, так называемых КМБ (костные  морфогенетические белки),  которые индуцируют  дифференцировку стромальных   клеток в клетки костной ткани - остеобласты.  Клинические  испытания  в этом направлении дали многообещающие результаты. Например,  в США 91-летней пациентке с незаживающим в течение 13 лет переломом вживили специальную коллагеновую пластинку с нанесенными на нее ВМР. Поступающие в зону перелома  стромальные  клетки “притягивались” к пластинке и под влиянием ВМР превращались в клетки костной ткани. Через 8 месяцев    после установки  такой пластинки  сломанная  кость у больной восстановилась. Сейчас в США  проходят испытания и скоро начнут широко применяться в клинике специальные пористые губки, наполненные одновременно и стромальными клетками и  нужными  индуцирующими веществами, направляющими развитие клеток по  требуемому пути.(Lovell-Badge R. 2001)

Большое  значение  придают  стволовым  клеткам (и, в  частности, стромальным) при лечении  различных  нейродегенеративных  и неврологических заболеваний – паркинсонизма, болезни Альцгеймера (старческое слабоумие),  хореи  Гентингтона,  мозжечковых  атаксий, рассеянного  склероза и др. Группа  неврологов из Американского национального института неврологических заболеваний и Стэнфордского университета  обнаружили,  что стромальные клетки костного мозга могут дифференцироваться  в нейральном направлении.  Следовательно, костный мозг человека может быть использован в качестве источника стволовых клеток для восстановления поврежденных тканей в  головном мозгу.

Возможна также трансформация  этих клеток в  печеночные,  почечные, в  клетки,  синтезирующие  инсулин,  что  может быть  использовано для  лечения диабета. Таким образом, пациент может стать собственным донором,  что предотвратит реакцию иммунологической несовместимости тканей. (Lovell-Badge R., 2001)

Предпринимаются успешные попытки  разработать  методы клинического  использования   стволовых  клеток  пуповины и плаценты (Gershon M., et al., 1997). В  связи с этим отпадает  необходимость  так  называемого  терапевтического  клонирования,  с  этической  точки  зрения  весьма  сомнительного.

         1.7.4. Лечение заболеваний с помощью генной терапии

                    Болезни - объекты генной терапии - могут быть разделены на две группы: наследственные и приобретенные.

                    Наследственные заболевания считались основными объектами генной терапии на начальном этапе ее развития. Это, как правило, моногенные заболевания, вызванные отсутствием или недостаточной функцией одного конкретного гена. Предполагалось, что введение такому больному нормально функционирующего гена приведет к излечению болезни.

                    Всем хорошо известна так называемая царская болезнь - гемофилия. В основе заболевания лежит дефект в генах VIII или IX фактора свертывания крови (гемофилия типа А или типа Б). Гены этих белков выделены и отсеквенированы, сформированы разнообразные ДНК-конструкции, содержащие эти гены, которые расположены на Х-хромосоме. Последнее обстоятельство служит причиной того, что данная болезнь передается по наследству по женской линии, но страдают ею практически только мужчины.

                   Для лечения гемофилий созданы ретровирусные конструкции, несущие гены факторов свертывания крови. Было показано, что они экспрессируются в фибробластах (соединительной ткани) кожи in vitro, однако при введении таких клеток в организм экспрессия оказывалась временной, что, по всей видимости, обусловлено отсутствием специфических промоторов, которые могли бы обеспечить постоянную работу трансгенов. Успех в лечении гемофилии был достигнут путем введения гена фактора IX свертывания крови; ген фактора VIII менее эффективен. Продемонстрирована продолжительная частичная коррекция гемофилии на моделях мышей и собак, и в 1999 г. начаты клинические работы по лечению гемофилии у человека (Taniguchi К., Kohsaka H., Inone N. et al, 1999)

                    Еще одно широко известное моногенное заболевание - миодистрофия Дюшенна - тоже связано с Х-хромосомой. Оно обусловлено дефектом в гене дистрофина. Больные мальчики к десятилетнему возрасту обездвиживаются и в последующее десятилетие наступает неизбежная смерть от нарастающей слабости сердечной и легочной мускулатуры (Culver K.W., Gene Therapy 1996, А.В. Зеленин, 2000)

                    Ненаследственные заболевания не связаны с врожденным дефектом в структуре и функции одного определенного гена. Генная терапия этих заболеваний базируется на предположении, что введенный в организм "лечебный ген" приводит к синтезу белка, оказывающего терапевтический эффект. Альтернативная схема основана на изменении свойств трансфицированных клеток, что вызывает лечебный эффект сам по себе или же делает эти клетки чувствительными к действию лекарственных препаратов.

Перечень наиболее распространенных приобретенных заболеваний - объектов генной терапии - насчитывает, по крайней мере, три десятка (Culver K.W., Gene Therapy 1996, А.В. Зеленин, 2000). Рассмотрим несколько конкретных примеров.

Сердечно-сосудистая система. Эта быстро растущая область генной терапии развивается в нескольких направлениях (Culver K.W., Gene Therapy 1996, А.В. Зеленин, 2000.).

Первое - предотвращение тромбообразования. Основная идея - генетическая модификация эндотелия кровеносных сосудов под действием генов, продукты которых могут предотвращать формирование тромбов (например, ген тканевого активатора плазминогена). К сосудистому эндотелию гены можно доставлять через катетер, введенный в кровеносный сосуд.

Второе направление - восстановление сосудистой системы сердечной мышцы после инфаркта миокарда путем введения генов, продукты которых индуцируют процесс сосудообразования (гены ангиогенеза). И наконец, профилактика и лечение атеросклероза благодаря введению генов, ответственных за синтез липопротеидов высокой плотности, которые необходимы для нормального процесса обмена жировых компонентов крови. Разрабатывается также генно-терапевтический подход к лечению атеросклеротических изменений сосудов путем предотвращения разрастания и миграции гладкомышечных клеток сосудистой стенки. С этой целью в них вводятся соответствующие гены - супрессоры пролиферации.

ВИЧ-инфекция. Обсуждается ряд подходов, один из которых основан на модификации генома Т-лимфоцитов и макрофагов под действием "доминантного негативного" гена revMIO, продукт экспрессии которого инактивирует функциональную матричную РНК вируса иммунодефицита. Предлагается также вводить антисмысловые конструкции, чтобы блокировать экспрессию генов тех или иных белков ВИЧ. Скептическое отношение к использованию генной терапии для лечения СПИДа, вызванное отсутствием способов полного подавления ВИЧ-инфекции в культуре ткани, сменяется умеренным оптимизмом.

Артриты. Лечение заболеваний суставов (ревматоидных артритов), по всей видимости, перспективная область генной терапии. В сустав вводят гены, продукты которых оказывают лечебный эффект, в частности, ген, кодирующий белок-антагонист рецептора интерлейкина-1. Ген клеточного старения используется для предотвращения избыточной пролиферации синовиальных клеток, покрывающих суставную сумку (Taniguchi К., Kohsaka H., Inone N. et al 1999). Еще один лечебный подход предусматривает доставку в суставную сумку антисмысловой конструкции, которая направлена на подавление синтеза белка FcappaB - одного из важнейших факторов воспаления (Makarov A.V., Kovalenko D.V., Brown C.E. et al 1998)  

              2. Флуоресцентные белки.

2.1.Открытие зеленого флуоресцентного белка

В 1955 году Давенпорт и Николь впервые описали светящиеся клетки медузы Aequorea victoria, которые оказались помимо люминесценции способны к флуоресцентной эмиссии зеленого света при облучении в УФ области спектра (Davenport and Nicol, 1955). Несколькими годами позже (Johnson et al., 1962; Shimomura et al., 1962) был описан белковый экстракт из медузы, способный к такой же флуоресценции. Затем Морин и Хастингс (Morin and Hastings, 1971) независимо обнаружили тот же белок, известный сегодня как GFP.

2.2. Биохимические, спектральные и физические свойства GFP

В отличие от других природных пигментов, GFP и известные GFP-подобные белки формируют внутренний хромофор без каких бы то ни было вспомогательных кофакторов (Wilson et al., 1998), и без использования внешних ферментативных активностей или субстратов, кроме молекулярного кислорода (Heim et al., 1994). Именно это уникальное свойство делает GFP-подобные белки исключительно удобными флуоресцентными маркерами, которые способны независимо формировать хромофор при экспрессии в различных живых организмах, тканях и клетках, Эти маркеры могут быть использованы без нарушения целостности объектов (Chalfie et al., 1994), могут быть специфично связаны в единый «фьюз» с интересующими белками, или направлены в конкретные органеллы или ткани (Cubitt et al., 1995). Дикий тип GFP имеет основной пик возбуждения флуоресценции при 396 нм, и минорный при 476 нм (рис.5). При этом спектры эмиссии флуоресценции для этих двух пиков очень близки - с максимумами при 503 и 508 нм (Ward, 1979; Ward & Cormier, 1979; Kahana & Silver, 1996).

                    Исследования физических и химических свойств GFP выявили несколько важных характеристик, относящихся непосредственно к структуре белка. GFP чрезвычайно устойчив к денатурации, для которой необходимо поместить белок в 6М гуанидин при 90°С либо вывести значение рН за границы между 4.0 и 12.0. Ренатурация (практически полная или частичная) происходит в течение нескольких минут после нейтрализации денатурирующих условий (Bokman and Ward, 1981; Ward and Bokman, 1982). В пределах денатурирующих значений, возрастание рН приводит к падению пика возбуждения флуоресценции при 396 нм, и возрастанию пика при 476 нм. (Ward et al. 1982) После кристаллизации GFP практически не изменяет своих флуоресцентных свойств по сравнению с GFP в растворе (Perrozo et al., 1998). Поэтому выяснение трехмерной структуры GFP методом рентгеноструктурного анализа, результаты которого были почти синхронно опубликованы в двух работах 1996 года (Оrmö et al., 1996; Yang et al., 1996) помогло объяснить как природу флуоресценции в зрелом белке, так и механизм автокаталитического формирования хромофора. Более того, последующие разработки флуоресцентных белков с различными свойствами во многом опирались и опираются именно на предсказуемые по трехмерным моделям изменения в структуре GFP.

2.3. Трехмерная структура GFP

GFP представляет собой -бочку с регулярным расположением 11 -слоев на внешней стороне цилиндра. Цилиндр этот имеет диаметр около 30 Ǻ и длину около 40 Ǻ. Флуоресцентной центр молекулы представляет из себя модифицированный остаток тирозина и дополнительный цикл, образованный циклизацией пептидного остова части -спирального сегмента. Небольшие  -спиральные участки также закрывают бочонок с торцов.  -слои расположены очень регулярно с единственным отклонением от совершенной симметрии между двумя из 11  -слоев  на внешней стороне цилиндра. В центральной части молекулы модифицированнйй остаток тирозина и дополнительный цикл, образованный циклизацией пептидного остова части  -спирального сегмента, образуют хромофор. Аминокислотные остатки  -слоев , обращенные внутрь  -бочки, формируют микроокружение хромофора, поляризуя его планарность. (Рис.2.1.)

              В результате, хромофор GFP способен к эффективной флуоресценции, спектры возбуждения/эмиссии, которой для белка дикого типа показаны на рисунке. (Рис.2.2)

Рис.2.2. Эмиссия белка GFP дикого типа (цифрами указана длина волны возбуждения)

                    Анализ гексапептида, полученного протеолизом очищенного белка позволил ещё в 1993 году предсказать, что хромофор образован внутренней последовательностью аминокислот Ser-Tyr-Gly, которая посттрансляционно модифицируется с образованием дополнительного цикла из пептидной цепи белка (Рис.2.3) (Cody et al., 1993).