Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

Рис.2.3.Формирование хромофора GFP

Хромофор образуется в две стадии: через быструю стадию циклизации между Ser65 и Gly67 с образованием имидазольного кольца и стадию окисления Tyr66.

                    Исследования экспрессии GFP в Е. coli позволили предложить последовательный механизм формирования хромофора: через быструю стадию циклизации между Ser65 и Gly67, с образованием имидазольного кольца и вторую, длящуюся часы, стадию окисления Tyr66 (Heim et al., 1994).

              Последующие работы по мутагенезу GFP (Delagrave et al., 1995; Heim et al. 1995) показали, что именно Gly в положении 67 строго необходим для формирования хромофора. По всей вероятности, такая консервативность позиции 67 обусловлена необходимостью сближения атомов пептидной цепи. Однако, среди белков с известной трехмерной структурой, содержащих последовательность SYG, в 10 из 206 белков степень сближенности атомом пептидного остова соответствует таковой у GFP (данные за 1997 год - Branchini et al., 1997). Таким образом, стерические условия выполнены, но циклизации не происходит. По всей вероятности, аргинин в позиции 46 (абсолютно консервативный среди известных на сегодняшний день GFP-подобных белков) играет ведущую роль в катализе реакции циклизации.

Химически были синтезированы аналоги хромофора GFP, которые оказались практически не флуоресцентны в водном растворе (Niwa et al., 1997). Таким образом, именно структура белка и «стратегические» аминокислотные позиции, окружающие хромофор, обеспечивают его стабилизацию и широкий квантовый выход флуоресценции. Каркас -бочки окружает хромофор на 3600по периметру и может быть использован для формирования разнообразного микроокружения хромофора. В условиях, которые определяют это микроокружение в молекуле GFP, хромофор способен эффективно поглощать в фиолетовой и синей областях спектра и выпускать фотоны с меньшей энергией, соответствующей сине-зеленому свету. Квантовый выход такой системы очень высок и составляет около 0.8.

3.4.Трехмерная структура красного флуоресцентного белка DsRed

              Первый флуоресцентный белок из класса Anthozoa - DsRed – стал так же и первым клонированным GFP-подобным белком, эмиссия флуоресценции которого расположена в  красной  области. Поэтому этот белок сразу же привлек внимание, как исследователей, собирающихся использовать его в качестве красной флуоресцентной метки, так и тех, кого заинтересовала собственно природа красной флуоресценции белка и степень его сходства или отличии от GFP, структура которого к тому времени была уже известна.

                    Практически одновременно вышли в свет две публикации, описывающие трехмерное строение белка DsRed (Wall et al., 2000). Данные о структуре, полученные по кристаллу белка показали, что в растворе белок DsRed существует в виде тетрамера (рис.2.4.), причем мономеры в тетрамере DsRed организованы как две антипараллельные пары. В результате хромофоры в тетрамере расположены по углам прямоугольника со сторонами около 2.7 и 3.4 нм (Wall et al., 2000).

В целом структура мономера DsRed очень близка к таковой GFP Aequarea. Это также -бочка из 11  -слоев с центральной -спиралью, несущей хромофор и заполняющей торцы цилиндра. Заметное различие состоит в том, что -бочка DsRed  сильно «сплющена» с боков(рис.2.4). В отличие от GFP Aequorea victoria, который, если смотреть на цилиндр с торца, образует практически идеальный круг, мономер DsRed выглядит в этом ракурсе как овал. Такая деформация сказывается на окружении хромофора. Как уже сказано выше, хромофор белка DsRed оказался довольно близок по строению к хромофору GFP, и также состоит из планарного п-гидроксибензилиден имидазолинона, образованного циклизацией пептидного остова между Glu65 и Gly67, с последующим дегидрированием С -С связи Tyr бб (рис 2.5.).

Однако, атом С Glu65 оказался в DsRed так же планарным, sp2 гибридизованным, формируя дополнительную двойную связь C=N. Окружение хромофора в белке DsRed высоко поляризовано и образует сложную сеть водородных и ионных связей. На рисунке 2.5.  показаны некоторые аминокислотные остатки, окружающие хромофор. Фенольный кислород Tyr 66 хромофора образует водородную связь с Ser148, абсолютно консервативным во всех известных флуоресцентных белках класса Anthozoa. Контакт между Tyr66 и Ser148, стабилизирующий хромофор, по-видимому, очень важен для эффективной флуоресценции.

Несмотря на близкое расположение Ser203 и Tyr66 не образуют водородной связи в отличие от Tyr66 и Thr203 в GFP. Тем не менее, мутации на позиции 203 существенно влияют на свойства белка DsRed. Так замена S203А ускоряет созревание белка, S203Т существенно увеличивает долю зеленой флуоресценции, а S203Y наоборот подавляет ее.

Средний участок хромофора DsRed расположен близко к Arg96, Lys69 и  Glu222 (рис.2.5). Arg96 является инвариантным для всех GFP-подобных белков. Вероятно, именно он участвует в катализе циклизации пептидного остова при формировании хромофора. Эволюционно консервативный Glu222 в DsRed так же ближе к хромофору, чем в GFP, и предполагается, что этот остаток так же важен для формирования хромофора. Lys69 образует ионную связь с Glu222. Позиция 69 во всех Anthozoa GFP-подобных белках занята либо l.ys, либо Arg. Положительный заряд в этом положении, по всей вероятности, необходим для организации полипептида, вне зависимости от его спектральных свойств.

3.5. Использование GFP-подобных белков для изучения подвижности клеток, клеточных белков и органелл.

С того времени, когда удалось клонировать ген GFP из A. victoria, и затем экспрессировать GFP в различных системах (Prasher et al., 1992; Chalfie et al., 1994) интерес к этому белку невероятно возрос. Сегодня GFP интенсивнейшим образом используется для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и организмов в широком диапазоне видов прокариот и эукариот.

Вскоре после открытия GFP стали применять как флуоресцентный маркер экспрессии генов,  локализации и динамики белков в живой клетке. Оказалось, что практически любой белок можно пометить с помощью GFP, закодировав его последовательность в той же рамке считывания. Экспрессируемая в клетке, такая химерная конструкция, как правило, сохраняет локализацию и функцию исходного белка. Открывшиеся возможности для исследования внутриклеточных процессов сделали GFP и гомологичные ему белки(позднее)  излюбленным флуоресцентным маркером для работ in vivo.

С ростом популярности развивались и совершенствовались и технологии применения флуоресцентных белков. Обогатилась палитра применяемых цветных маркеров. Были получены мутантные формы GFP: синий (BFP), циановый (CFP), желтый (YFP) с максимумами эмиссии флуоресценции соответственно 445, 477 и 527 нм (Heim et al 1994, Delagrave et al 1995, Heim and Tsien 1996, Ormö et al 1996, Patterson et al 2001). Начиная с 1999 года, было также клонировано множество GFP-подобных флуоресцентных белков из коралловых полипов, обладающих спектрами эмиссии с максимумами от 445 до 611 нм. Кроме того, из коралловых полипов были клонированы гомологичные не флуоресцентные хромобелки, на базе которых удалось получить мутантные флуоресцентные формы, пик эмиссии некоторых из которых достиг 645 нм (Gurskaya et al 2001). (Рис.2.6.)

Сегодня разнообразие флуоресцентных белков позволяет одновременно маркировать и локализовать в живой клетке несколько объектов, а так же использовать технологию FRET-микроскопии (Fluorescence Resonance Energy Transfer - флуоресцентный резонансный перенос энергии), позволяющую определить наличие физических взаимодействий между белками. На базе GFP-подобных белков были созданы сенсорные молекулы, реагирующие изменениями в интенсивности и спектре флюоресценции на изменение параметров окружения, концентрации ионов Са2+ (Miyawaki el al., 1997; Baird, el al., 1999; Nagai el al., 2001), pH (Llopis et al., 1998., Elsliger  et al, 1999, Hanson et al., 2002; McAnaney et al., 2002), мембранного потенциала (Siegel et al., 1997) и других параметров. Были разработаны варианты GFP-подобных белков, позволяющих in vivo отслеживать временные параметры экспрессии по изменению цвета флуоресценции с зеленого на красный - по мере созревания хромофора белка (Terskikh et al., 2000)

Кроме того, на базе GFP и гомологичных ему белков был разработан ряд белков, позволяющих либо косвенно оценить подвижность молекул в живой клетке, либо оптически внести характерный флуоресцентный сигнал и непосредственно проследить за перемещением помеченных молекул.

Однако, тетрамерная   природа  подавляющего   большинства  GFP-подобных белков, клонированных из коралловых полипов, является их главным и очень серьезным недостатком. Во многих случаях попытки использовать такие тетрамерные белки для мечения клеточных белков приводят к агрегации полученной химеры и полному нарушению функции и локализации исследуемого белка. При этом основной проблемой является даже не четырехкратная (относительно GFP) величина метки, а образование сложной сетки взаимодействующих белков, приводящее к формированию крупных комплексов и агрегации. В последнее время эта важная проблема находит свои решения (Lаuf et al., 2001; Fradkov et al., 2002; Campbell et al., 2002; Gavin et al., 2002).

В любом случае, очевидно, что флуоресцентный маркер, используемый для изучения белков in vivo, должен быть настолько мал, насколько это возможно: тем  меньше будет искажена  функция исследуемого белка. Небольшие химические флуоресцентные красители до последнего времени не удавалось адресно привязать к экспрессируемым в клетках белкам in vivo.

Только в 2002 году была разработана технология, которая сделала такое включение возможным, путем избирательного связывания химического агента небольшим линкером из нескольких аминокислот (Gaietta et al, 2002). Однако эффективность этой технологии ещё нуждается в проверке на практике. И, в любом случае, на базе этой технологии пока невозможно разработать фотоактивируемый флуоресцентный маркер. Попытки уменьшить молекулу GFP без значительных потерь в яркости флуоресценции оказались безуспешными, и сегодня наилучший маркер с использованием GFP-подобного белка это мономерный GFP-подобный белок. Таким образом, оптимальная фотоактивируемая метка, которая может быть разработана на основе GFP-подобного белка, должна быть способна к прямой активации в мономере.

Рис. 2.6.Спектры возбуждения и эмиссии флуоресцентных белков-вариантов GFP (А-спектр возбуждения. В-спектр эмиссии.)

                                                               3.Векторы

                    В качестве основы для конструирования векторных молекул широко использовался геном одного из паповавирусов приматов – вируса обезьян 40 (SV40). В настоящее время на основе некоторых вирусов эукариот созданы интересные системы хозяин – вектор. Для млекопитающих это папилломавирусы, аденовирусы, вирус Эпштейна – Барр, вирус оспы крупного рогатого скота и ретровирусы, а для насекомых – бакуловирусы.

При работе с животными клетками используют два типа векторов. В некоторых случаях они аналогичны бактериальным плазмидам или фаговым векторам. После трансфекции или инфицирования эти векторы реплицируются и сохраняются в виде независимых внехромосомных геномов или упаковываются в инфекционные вирусные частицы. В других случаях векторы не способны реплицироваться, и используются для введения специфических сегментов ДНК в клетки с целью изучения временной экспрессии клонированного гена или получения стабильной трансформации при встраивании вектора в геном хозяина. (М. Сингер, П. Берг, 1998)

3.1. Вектор pcDNA 3.1+

Вектор фирмы “Invitrogen” pcDNA3.1+ предназначен для высокого уровня временной или постоянной экспрессии в различных клеточных линиях млекопитающих. Общий размер – 5428 пар нуклеотидов. Вектор содержит гены устойчивости к ампицилину (Amp) и неомицину (Neo), которые являются маркерами (стабильные клеточные линии).  Структура вектора:

      промотор человеческого цитомегаловируса (CMV) высокого уровня экспрессии

      BGHpA – последовательность полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции из гена бычьего гормона роста (bovine growth hormone) для увеличения стабильности мРНК

      SV40 origin для эписомальной репликации и устойчивости вектора в клеточных линиях, экспрессирующих SV40 large Т-антиген (Так же COS1 и COS7)

      первичный сайт  Т7 промотора для in vitro транскрипции  sense RNA и сиквенирования  вставок

      f1 origin для сохранения однонитевой ДНК для мутагенеза и сиквенирования

      Ген устойчивости к ампицилину  для селекции колоний в E.coli (Fu YG et.al., 2003)

3.2. CMV-промотор

Цитомегаловирусный промотор активен во многих клеточных культурах и считается одним из сильнейших промоторов in vitro.Подходящая экспрессия в трансгенах – главное требование в соматической генной терапии. Для достижения высокого уровня трансгенной экспрессии in vivo широко используются сильные вирусные промоторы. Так как цитомегаловирусный промотор (CMV промотор) человека считается одним из самых сильных промоторов in vitro,он используется для in vivo экспрессии терапевтических генов многими исследователями. (Peter Löser et.al., 1998)

Хотя цитомегаловирусный промотор предусматривает очень сильную краткосрочную экспрессию трансгенов in vivo, он молчит  в течение нескольких недель, после трансфекции  во многих  исследованиях животных. В большинстве случаев экспрессия  от CMV промотора имеет пик на 2-ой-4-ый день после доставки трансгена и уменьшается в течение 4-х недель до едва обнаруживаемой  активности. Это молчание CMV промотора было обнаружено как для имунокомпетентных, так и для имунодифицитных мышей и представляется независимым от векторной системы,  метода трансдукции и используемых видов (Dai Y., M. Roman et.al., 1992, Guo Z. S., L.-H. Wang et.al., 1996) Интересно, что комбинирование CMV-промотора с другими регуляторными элементами дает длительную экспрессию в трансплантируемых миобластах, предполагая, что ингибирование промотора может быть преодолено с помощью других транскрипционно активных элементов (Dai, Y., M. Roman et.al., 1992)

Человеческий цитомегаловирусный промотор состоит из, по крайней мере, 4-х типов повторяющихся последовательностей (17-, 18-, 19-, 21- пар оснований), которые присутствуют 3-5 раз в области промотора и образуют комплексы с ядерными белками (Peter Löser et.al., 1998)